蜂蜜酒对肠道微生物和肠黏膜免疫功能的影响

杨晓婷，陈 涛，杨晓满，赵可及，陆筑凤，李加友

（1.嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001；2.宿迁市产品质量监督检验所，江苏宿迁 223800）

蜂蜜是蜜蜂从开花植物的花中采得的花蜜，在蜂巢中酿制而成。《神农本草经》把“石蜜、蜂子、蜜蜡”列为上品，指出其有“除百病、和百药”的作用，且“多服久服不伤人”[1]，可见蜂蜜的保健功能很早就被认识到。随着蜂蜜产业的发展，高附加值蜂蜜产品的开发成为一种趋势。蜂蜜酒是以蜂蜜加水稀释后经特殊工艺生产的发酵酒，含有多种人体必需的氨基酸、矿物质和维生素，有极高的营养价值；酒精含量在10%vol～14%vol，不含甲醇和甲醛[2]；口感独特，备受消费者的青睐。因此，评估蜂蜜酒的生物学功效，并与其他市售同类产品进行比较，为蜂蜜酒的深入开发奠定基础。

肠道微环境主要包括4种屏障：微生物形成的生物屏障、肠黏膜免疫屏障、消化液及抑菌物质等形成的化学屏障和上皮与细胞形成的机械屏障[3]。本文主要研究生物屏障和肠黏膜免疫屏障，肠道表面定殖着大量的微生物，它们共同参与肠道吸收、免疫调节等过程，共同维持肠道的健康与平衡。肠黏膜碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是肠道吸收消化的标志性酶类物质，与肠道微生物的组成和丰度存在密切关系，当肠道中革兰氏阴性菌多时，肠碱性磷酸酶活性增高，说明肠道中潜在的致病菌多[4]。此外肠黏膜免疫屏障中分泌型免疫球蛋白SIgA也会参与肠道免疫调节，抵御病原菌的侵害，防止肠道炎症的产生，分泌型免疫球蛋白SIgA含量越高，说明肠黏膜免疫屏障越强[5]。

目前关于酒精饮品生物学效应的评价很多，大部分从肝功能着手，探究酒类物质对肝脏乙醇脱氢酶、胸腺指数、脾脏指数的影响[6-7]，而近些年发现肠道和宿主健康存在密切的联系[8-9]，因此使用肠道相关指标来评价蜂蜜酒对健康的影响非常重要，本文拟就蜂蜜酒对小鼠生长、肠道微生物和宿主免疫因子的影响进行研究，进而初步揭示蜂蜜酒对人体肠道健康的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

试验小鼠：以4周龄的雌性昆明小鼠为试验对象，随机分成4组，每组5只重复，分别命名为纯净水组、酒精组、蜂蜜水组、蜂蜜酒组，其中酒精组为阴性对照。设置处理小鼠的酒精最终浓度是0.11%vol，该浓度对小鼠生理活动没有任何影响，将试验材料加入至小鼠饮用水中正常喂养，处理30 d，每只小鼠饮水量为9～12 mL/d。

试剂及耗材：阴性对照为食用酒精（酒精度55%vol）。蜂蜜水是将市售蜂蜜（糖度40°Bx）原液与水按1∶4稀释而成，蜂蜜来源于浙江省嘉兴市平湖养蜂场，主要成分为总糖（葡萄糖和果糖）80%，水15%，还有蛋白质、矿物质、果胶、维生素等；蜂蜜酒是以上述配制的蜂蜜水为原材料，加入安琪酵母发酵而得，酒精浓度为14%vol，主要成分为酒精14%vol、总氨基酸1.5 g/L、矿物质1.1 g/L。

1.2 试验方法

1.2.1 食物转化率计算

1.2.2 肝脏切片观察

将喂养30 d的小鼠解剖，取肝脏组织用10%中性甲醛固定，完成后进行梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色后用中性树脂胶封片，用光学显微镜观察肝脏组织结构。

1.2.3 肠道微生物活菌计数

将喂养30 d的小鼠粪便收集后于厌氧箱中直接进行10倍系列稀释，选择运用不同的培养基对大肠杆菌（Escherichia coli）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳酸杆菌（Lactobacillus）进行活菌计数，选择培养基平板分别为麦康凯培养基、BBL培养基和MRS琼脂培养基，其中双歧杆菌和乳酸杆菌使用完全厌氧培养。

1.2.4 碱性磷酸酶活性测定

小鼠喂养30 d后断颈，解剖得小肠组织，取小肠前1/3段，用0.9%生理盐水洗掉残渣，用细胞刮刀刮取小肠黏液于1.8 mL无菌生理盐水中，称重，并加入2颗钢珠匀浆，3000 r/min离心20 min，收集上清液，速冻分装保存。将所取的小肠黏液层上清液从-80℃取出置于冰上至融化，考马斯亮蓝法测定黏液层上清液中的总蛋白。同时将上清液稀释10倍后，用碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程有限公司）检测，通过计算每克蛋白与酚反应的金氏单位来定量碱性磷酸酶活性。

1.2.5 肠黏膜SIgA含量测定

将上述所取的小肠黏液层上清液从-80℃取出置于冰上至融化，按照分泌型免疫球蛋白SIgA酶联免疫试剂盒说明书进行检测，试剂盒来源于南京建成生物工程有限公司。

1.2.6 数据处理

数据处理采用GraphPad统计软件，采用非配对t检验进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜酒对肝脏的影响（图1）

图1 不同处理组小鼠肝脏切片的显微对比

长期过量饮酒会对肝脏造成损伤，通过对喂养30 d后小鼠的肝脏进行对比，发现蜂蜜水组、蜂蜜酒组的小鼠肝脏颜色鲜红，柔软有弹性，而阴性对照（酒精组）的小鼠肝脏颜色偏黄，有稍微的硬化。切片观察发现（图1），酒精组肝脏胞腔中出现大小不等的空泡，边界清晰，属于肝细胞脂肪变性，而其他处理组的肝脏细胞排列均匀，细胞核明显，细胞与细胞间界限清晰，说明蜂蜜酒对小鼠肝脏没有明显的影响。

2.2 蜂蜜酒对食物转化率的影响（图2）

图2 不同处理对小鼠食物转化率的影响

为探究不同处理组对小鼠生长的影响，每5天记录其饮食量和生长情况。试验发现，阴性对照组（酒精组）的小鼠食物转化率明显低于纯净水组，在第5天时两者相差11.9%；而蜂蜜水组和蜂蜜酒组的小鼠食物转化率明显高于纯净水组，在第5天时差异最明显。说明酒精会降低小鼠的食物转化率，影响其正常生长；而蜂蜜水和蜂蜜酒会增加食物转化率以促进生长，可能是因为蜂蜜水和蜂蜜酒中均含有一定量的营养物质和其他生物活性物质，可以抵抗酒精对食物消化的负面作用。

2.3 蜂蜜酒对肠道微生物生长的影响（图3）

图3 不同处理对小鼠肠道微生物生长的影响

为比较各种处理对小鼠肠道微生物的作用，通过活菌计数的方法检测粪便中大肠杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌的含量，实验发现，酒精组小鼠粪便中大肠杆菌的含量（图3A）显著升高（p＜0.05），而蜂蜜酒组大肠杆菌含量显著下降（p＜0.05），说明蜂蜜酒对肠道潜在致病菌（大肠杆菌）有显著的抑制作用。酒精组（图3B）小鼠粪便中双歧杆菌含量显著降低（p＜0.05），蜂蜜水组和蜂蜜酒组处理后双歧杆菌含量极显著升高（p＜0.01），说明蜂蜜水和蜂蜜酒都能促进肠道中双歧杆菌的生长。就肠道中乳酸杆菌的变化而言（图3C），酒精组的乳酸杆菌生长受到极显著抑制（p＜0.01），而蜂蜜酒组的乳酸杆菌和纯净水组比较，没有显著的影响（p＞0.05），说明蜂蜜酒对乳酸杆菌的含量没有显著影响。因此研究结果表明，蜂蜜酒有改善肠道微生物的作用。

2.4 蜂蜜酒对肠碱性磷酸酶活性的影响（图4）

图4 不同处理对碱性磷酸酶活性的影响

为探究各种处理对小鼠肠碱性磷酸酶含量的影响，实验处理后取各组小鼠肠黏膜进行检测，发现（图4）酒精组小鼠肠碱性磷酸酶活性显著上升（p＜0.05），蜂蜜水组肠碱性磷酸酶活性没有显著变化（p＞0.05），而蜂蜜酒处理小鼠30 d后，AKP活性显著性降低（p＜0.05）。碱性磷酸酶是肠道消化吸收的关键酶，其活性与肠道病原菌的含量密切相关，当其含量降低时，说明肠道中病原菌受到抑制，炎症产生概率小。因此饮用蜂蜜酒对肠道病原菌有一定的抑制作用。

2.5 蜂蜜酒对肠黏膜SIgA含量的影响（图5）

图5 不同处理对肠黏膜SIgA含量的影响

肠黏膜免疫球蛋白SIgA是肠道黏膜屏障的主要效应因子，其含量升高说明肠黏膜的稳定性、免疫能力增强，抑制肠道炎症和感染的发生[11]，相反则说明肠黏膜免疫处于抑制状态，有损肠道健康。试验发现，酒精组小鼠肠道SIgA含量显著下降（p＜0.05），小鼠肠黏膜免疫力低下；而蜂蜜酒组肠黏膜SIgA有显著提升（p＜0.05），说明饮用蜂蜜酒能增强肠道免疫能力，抑制肠炎的产生，保护肠道。相比较而言，蜂蜜水对肠黏膜SIgA的促进作用弱于蜂蜜酒，说明蜂蜜水经发酵后的产物——蜂蜜酒对宿主的保健能力更强。

3 讨论

本实验通过动物试验评估了蜂蜜酒对小鼠生理、肠道健康的影响，试验发现，长期饮用蜂蜜酒对肝脏没有显著的负面影响，同时还能提高小鼠的食物利用率，促进生长，提高免疫机能，具体原因可能包括以下几点：

（1）研究表明，低剂量的酒精会增强肠道通透性[12]，促进营养物质的消化吸收；但是，相同酒精浓度的酒精组的食物利用率却很低，说明酒精对小鼠生长具有其他负作用，导致小鼠食物利用率低，而蜂蜜中含有抵抗酒精负面作用的生物学活性成分。

（2）蜂蜜水经过酿造加工而成的蜂蜜酒保留了原有的益生成分[13]，如氨基酸、矿物质和维生素等，这些益生成分对肠道微生物具有改善作用，促进有益菌生长的同时抑制潜在致病菌。有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌在免疫调节、降低血液中胆固醇、产生代谢物抑制有害菌的侵染方面具有重要作用[14]，而肠道中潜在致病菌大肠杆菌含量较高时会引起肠道炎症的产生，导致腹泻[15]。肠道微生物的组成和相对丰度直接与肠道的消化吸收、免疫调节密切相关[16]。因此，蜂蜜酒可以通过改善肠道微生物的组成促进食物的消化吸收，增加食物利用率，促进生长。

（3）饮用蜂蜜酒增强肠道生物屏障和肠黏膜免疫功能。

其一，肠道微生物形成的生物屏障影响肠碱性磷酸酶的活性[17]，而肠碱性磷酸酶参与肠道的消化吸收和免疫平衡的调节。正常菌群中存在大量的革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、变形杆菌等，这些阴性菌表面的脂多糖在肠道中的浓度也相对较高，当其进入血液循环时会诱导机体产生炎症，甚至休克，而肠黏膜碱性磷酸酶会催化脂多糖去磷酸化，间接抑制炎症反应的发生[18]，阴性菌含量越低，碱性磷酸酶活性越低，肠免疫能力越强[19]。研究结果表明，蜂蜜酒处理小鼠后，大肠杆菌的含量显著降低（p＜0.05），与此同时肠黏膜碱性磷酸酶的活性显著下降（p＜0.05），该结果与前人研究结果一致，说明蜂蜜酒对肠道具有保护作用。

其二，肠黏膜SIgA是肠道黏膜屏障的主要效应因子，由浆细胞分泌产生，参与形成肠黏膜的稳定性、防止肠道感染的发生[20]。陈丽梅等[21]研究发现枯草芽孢杆菌YK-1R饲养断奶仔猪，能增加菌群多样性及提高SIgA的分泌，增强肠道免疫能力，促进生长。贾玉臣等[22]用瑞士乳酸杆菌灌胃小鼠，肠黏膜SIgA含量显著升高，肠道免疫能力明显增强，说明SIgA显著增高能提高肠道免疫功能，促进肠道消化吸收，提高食物转化率。同时此前相关研究也证明SIgA的分泌与肠道微生物之间也存在密切的关系[23]。肠道益生菌的定殖促进了SIgA的分泌，而SIgA的分泌同时也会促进益生菌的定殖，两者相互作用，共同维持肠道健康，促进生长。本文试验结果也表明，蜂蜜酒能显著改善肠道微生物的相对丰度，促进有益菌双歧杆菌、抑制潜在致病菌大肠杆菌的生长，同时蜂蜜酒处理组的肠黏膜免疫球蛋白SIgA的含量也显著增加（p＜0.05），与前人研究结果一致。因此蜂蜜酒可以通过提高肠道免疫功能，抵御病原菌入侵，促进宿主健康。

综上所述，蜂蜜酒可以通过改善肠道微生物和肠黏膜免疫来促进宿主健康，与蜂蜜水相比而言对肠道保健效果更明显。目前通过改善饮食来调理肠道微生物成为当下维持健康生活状态的首选方式[24-25]，我们的研究工作为蜂蜜产业的深度开发和蜂蜜酒的生产奠定理论基础。