超高效液相色谱-串联质谱法检测肉丸中诺氟沙星药物残留

摘  要：采用甲酸化的乙腈溶液提取肉丸中诺氟沙星药物，并采用固相萃取净化提取液，建立了肉丸中诺氟沙星的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经2%甲酸乙腈提取，提取液盐析，取乙腈层过固相萃取柱净化，在电喷雾离子源正离子模式下，多反应离子监测进行测定，内标法定量。诺氟沙星药物在2.0～50 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9997。在3个不同添加水平下的平均回收率为87.0～91.0%，相对标准偏差为6.2～7.1%（n=6），检出限为0.5 μg/kg。该方法操作简便、快速，净化效果好，灵敏度高，适用于肉丸中诺氟沙星药物残留的快速分析检测。

关键词：固相萃取;超高效液相色谱-串联质谱法;诺氟沙星;肉丸

中图分类号：TS251    文献标识码：A    文章编号：1671-2064（2019）16-0000-00

诺氟沙星是第三代喹诺酮类抗菌药物中的一种，该药物为广谱抗菌抗菌药，其见效快，且成本低，因此被广泛的使用到动物的养殖中^[1]，为畜禽和水产专用抗菌药物，但部分养殖户过度使用该类药物，或未注意休药期，导致畜禽和水产产品中该类药物残留较多，同时当前对于肉丸类食品中该种残留没有限量指标，因此建立肉丸中诺氟沙星的检测方法具有重要的实际意义。

目前，食品中诺氟沙星的检测方法主要有液相色谱法^[2]、液相色谱-质谱联用法^[3-6]。本文以市售的肉丸为研究对象，对其诺氟沙星药物检测的样品前处理条件进行了选择和优化，超高效液相色谱-串联质谱检测器检测，对液相分离条件和质谱检测条件分别进行了优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱检测肉丸中诺氟沙星的检测方法，并对市售的10批次实际样品进行了检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

WATERS TQD质谱仪（美国WATERS公司）;XEVO超高效液相色谱仪（美国WATERS公司）;BEH Shield C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm，美国WATERS公司）;高速冷冻离心机（美国热电公司）; Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）;氮吹仪（上海屹尧仪器科技发展有限公司）;涡旋混合仪（德国IKA公司）; Oasis HLB固相萃取柱（美国WATERS公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher公司）;甲酸，色谱纯（上海安谱科学仪器有限公司）;氯化钠、氨水均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司;水为Milli-Q超纯水仪制备的超纯水。

标准品诺氟沙星购置于中国食品药品检定研究院，纯度为99.5%。

1.2标准溶液的配制

精密称取诺氟沙星标准品适量，加入0.2 mL甲酸，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成质量浓度约是1.0 mg/mL标准储备液，置于棕色瓶中，于冰箱-18℃中保存。用时根据需要，用0.1%甲酸-乙腈（95：5）溶液逐级稀释为标准工作液，临用现配。

1.3样品处理

试样经均质器均质后，称取约5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入15 mL2%甲酸乙腈溶液，涡旋混合30 s;8000 r/min离心10 min，将上清液转移至另一离心管中，残留物再用10 mL1%甲酸乙腈溶液提取两次，合并三次提取液;加入10 mL乙腈饱和的正己烷，涡旋30 s，取乙腈层于氮气流下吹至近干，加入5 mL水，涡旋混合，10000 r/min的速度离心5 min待净化。

将样品溶液转移至固相萃取柱中（固相萃取柱依次用6 mL甲醇、6 mL水活化），以6 mL水洗涤小柱，抽干后，用乙腈-1 mol/L氨水（95：5）溶液6 mL洗脱，收集洗脱液于氮气流下吹至近干，用初始比例流动相1.00 mL复溶，涡旋混合，过0.22 μm有机滤膜供UPLC-MS/MS分析测定。

1.4基质标准溶液配制

取空白基质麻辣烫样品，按1.3方法处理至浓缩至近干，用标准工作液1.0 mL复溶，涡旋混合30 s，过0.22 μm滤膜，即得。

1.5 色谱和质谱条件

色谱柱：BEH Shield C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）;柱温：30 ℃;进样量：5 μL。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈溶液;流速：0.35 mL/min。梯度洗脱程序见表1。

电喷雾离子源（ESI）;正离子扫描;多反应离子监测（MRM）;喷雾电压：2 kV;雾化气温度：400 ℃;雾化气流速：0.8 L/min;质谱采集参数见表2。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

本研究中先后考察了乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，诺氟沙星的响应情况。结果表明，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，诺氟沙星的离子化效率有所提高，且峰形较好，因此乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流动相;后又考察了不同浓度的甲酸水溶液对诺氟沙星的响应影响情况，发现变化不大，因此最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

采用选定的流动相和色谱柱，对标准工作液进行检测，优化梯度洗脱程序，使诺氟沙星具有较好的峰形和灵敏度。图1为10ng/mL诺氟沙星标准工作液的总离子流色谱图。

2.2质谱条件优化

通过质谱端直接进样的方式将500 ng/mL的诺氟沙星标准工作液引入质谱检测器，分别进行正离子和负离子全扫描分析，发现诺氟沙星的最佳准分子离子峰在正离子扫描模式下获得。以其准分子离子为母离子，不断改变锥孔电压，选择准分子离子响应最高的电压作为锥孔电压;再通过改变碰撞电压，将准分子离子打碎，并检测子离子，选择稳定且响应最好的两个子离子作为特征子离子，其中丰度相对较强的为定量离子，另一个作为定性离子，再对两个特征子离子的碰撞能量进行分别优化，使定量离子和定性离子的响应均达最优。优化得到的质谱参数见表2。

2.3樣品前处理条件的优化

肉丸样品基质比较复杂，含有较高的蛋白、脂肪，同时还有不同含量的调味品等，因此对样品中的诺氟沙星提取后，要采用一定的净化手段去除大量的杂质，以期得到较为干净的待测液和较好的检测灵敏度。对于提取溶剂，我们选择了现有研究中常用的酸化乙腈溶液，并考察了添加不同体积分数的甲酸乙腈溶液的提取效果，实验表明2%甲酸乙腈溶液作为提取液即可达提取效率最优。肉丸样品中含有一定量的油脂，提取时也一并提取到提取液中，对后续的净化和检测均有影响，因此选择乙腈饱和的正己烷对提取液进行除油操作。

2.4 线性方程、检出限

按照1.4项的方法配制5个水平的基质标准溶液，并采用优化的色谱和质谱条件进行检测。以诺氟沙星定量离子的峰面积（y）作为纵坐标、质量浓度（x，μg/L）为横坐标绘制标准曲线，线性范围为2.0～50 μg/L，相关系数r为0.9997，线性关系良好，检出限为0.5 μg/kg。

2.5回收率和精密度

在空白肉丸样品中添加诺氟沙星标准溶液，制备含量分别为1.0、2.0和5.0 μg/kg的加标样品，按照前处理方法及优化的检测条件进行试验，每个添加水平平行测定6份，结果见表3，平均回收率为87.0～91.0%，相对标准偏差为6.2～7.1%。

2.6 实际样品检测

采用本文建立的方法，对10批次市售肉丸食品进行检测，9批次均未检出，1批次检出含有诺氟沙星，含量为7.6 μg/kg。

3结语

本文采用酸化乙腈溶液对肉丸食品中的诺氟沙星进行提取，并使用HLB固相萃取柱净化提取溶液，分别优化了诺氟沙星检测的液相色谱分离和质谱检测条件，建立了UPLC-MS/MS检测肉丸中诺氟沙星药物的分析方法，并将该方法用于市售肉丸食品的检测中。该方法操作简便、快速，其灵敏度较高，回收率和精密度均符合检测技术的要求，可用于肉丸食品中诺氟沙星的检测。

参考文献

[1] 兰海.浅谈喹诺酮类药物的发展与合理应用[J].疾病监测与控制杂志，2014，8（10）： 649-650.

[2] 祝曙华，苏青云.四种固相萃取柱在猪肉四种氟喹诺酮类药物残留检测中应用比较[J].色谱安全质量监测学报，2014，5（2）：415-419.

[3] 刘辉，谭素娴.固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中多种兽药的残留量[J].理化检验（化学分册），2014，50（4）：439-444.

[4] 郭霞，孙建华，孙振中，刘菁华，黄雪玲，刘云璐，陈琳.水产品中喹烯酮和喹赛多及其主要代谢物的HPLC-MS/MS检测方法研究[J].分析测试学报，2016，35（12）：1535-1541.

[5] 张颖颖，李莹莹.超高效液相色谱-串联质谱测定猪肉中16种喹诺酮药物残留量[J].肉类研究，2016，30（5）：36-41.

[6] 张科明，梁飞燕，邓鸣，刘向红，许杨彪，赵庄.QuEChERS结合液相色谱-串联质谱法快速测定猪肉中多类兽药残留[J].色谱，2016，34（9）：860-867.

收稿日期：2019-07-05

作者简介：程海霞（1988—），女，汉族，湖北武汉人，硕士，实验工程师，助理实验师，研究方向：食品化妆品农兽药残留检测。

Determination of Norfloxacin in Meat balls using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometric

CHEN Hai-xia

（Wuhan Customs Technology Center，Wuhan Hubei 430050）

Abstract：An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric （UPLC-MS/MS） method was established to determination of the norfloxacin in meat balls. Samples were extracted with acidified acetonitrile and separated on SPE column， and analyzed by UPLC-MS/MS under the positive mode using multiple reaction monitoring（MRM）. The method showed good linearities over the range of 2.0～50 ng/mL with good linear correlation coefficients （r=0.9997）. The method detection limit of the norfloxacin was 0.5 μg/kg， and the recovery of norfloxacin in meat balls ranged from 87.0～91.0 % with the relative standard deviations （RSD） of 6.2～7.1% （n=6）. The results indicated that this method is simple， fast and clean， and suitable for the simultaneous determination for the norfloxacin in the meat balls.

Key words：SPE; Ultra Performance Lquid Chromatography-tandem Mass spectrometric （UPLC-MS/MS）; Norfloxacin; Meat balls