两种不同分离方法的唾液多肽组分析结果比较

孔祥怡　杜建时　徐金玲　李水明　王勇　赵晴

摘 要 唾液多肽经Zip-Tip C18固相萃取和氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料（LaGM）两种方法分离后，利用高分辨串联飞行时间质谱进行多肽鉴定， 将重复两次的结果合并， 比较两种方法的异同。利用Zip-Tip C18方法共检测到归属于38种蛋白质的545条序列特异肽段， 而LaGM方法检测到了来源于44种蛋白质的359条序列特异肽段， 其中二者重合的有116条肽段， 归属于21种蛋白质。两种方法所得的肽段分布特征和优势肽段构成存在明显差异， Zip-Tip C18更多富集Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Statherin和Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2等蛋白质的肽段， 而利用LaGM方法可检测更多的来源于Histatin-1、Histatin-3和Protein S100-A8的肽段， 考慮翻译后修饰， 结论一致。以上结果表明， 这两种方法对多肽的富集有一定偏好性， 即多肽分离过程有可能导致肽段的特异性丢失。进一步分析发现， 丢失肽段可能是检测到肽段的序列相关肽段、修饰相关肽段、所归属蛋白质的其它肽段或其它蛋白质的肽段， 但序列相关肽段的几率更大。本研究表明， 不宜用单一分离方法的结果代表整个多肽组， LaGM方法虽然检出肽段数目较少， 但可以获取更多的降解蛋白质的信息。

关键词 多肽组; Zip-Tip C18; 氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料; 唾液; 高分辨串联质谱

1 引 言

多肽组是指组织、细胞或体液等生物样品中的全部多肽[1]， 反映了生物体内蛋白质的降解情况， 是蛋白质组学的延伸和补充。临床体液样本中多肽的分子量、序列和翻译后修饰等信息有可能成为潜在的生物标志物[2， 3]。根据分离方式的不同， 多肽分离方法可分为以下几类：（1）利用半透膜、凝胶过滤或超滤离心管分离[4，5]; （2）利用三氯乙酸或有机溶剂沉淀富集[6，7]; （3）利用亲和层析方法富集结构特异性肽段[6]; （4）利用Zip-Tip C18固相萃取柱萃取（以下简称Zip-Tip C18）[9]; （5）基于不同分离原理的纳米材料磁珠富集[10]， 分离后的多肽进一步通过质谱进行分子量或序列分析。Aristoteli等[11]发现， 对于血浆多肽组， 固相萃取优于超滤和有机溶剂沉淀等方法， 但该工作鉴定到的肽段分子量多小于2000 Da。目前， 关于不同分离方法对多肽组分析结果的研究尚不深入。在以上四类方法中， Zip-Tip C18固相萃取法和纳米材料磁珠富集法因操作简便、快速而使用较多， 本研究组在前期工作中建立了基于氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料（LaGM）的体液多肽组分析方法[12]。本研究以唾液为体系， 比较了Zip-Tip C18和LaGM两种分离方法， 发现它们的结果既有重叠， 也在肽段水和蛋白质水平表现出了不同的特征， 说明唾液多肽组的分析结果与分离方法具有相关性， 利用单一分离富集方法得到的结果不宜代表全部多肽组。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Eksigent nanoLC-UltraTM 2D 系统、TripleTOF560高分辨质谱仪、Protein Pilot 4.5软件（美国AB SCIEX公司）; 真空冷冻干燥机（美国Thermo Savant公司）。氧化石墨烯-磷酸镧纳米复合材料（LaGM）为本实验室合成[12]。PierceTM C18 Tips固相萃取柱（美国Thermo Scientific公司）。甲酸、乙腈（ACN， 质谱纯， 美国Sigma Aldrich 公司）。

2.2 多肽的分离和富集

唾液来源于一名健康男性志愿者。取0.5 mL人唾液与 0.5 mL去离子水混合， 取0.5 mL样品， 按照文献[12]方法， 利用LaGM磁性纳米材料富集; Zip-Tip C18方法：取剩余0.5 mL唾液样品， 加到10 kDa超滤离心管的样品套管中， 离心1 h（4℃， 12000 r/min）， 收集含有多肽组分的流出液， 冷冻离心至10 μL。取10 μL 50% ACN活化C18 Tips柱， 重复一次; 取10 μL 0.1%三氟乙酸（TFA）溶液平衡C18 Tips柱， 重复一次; 上样10 μL， 收集 10 μL含0.1% TFA-5% ACN的洗脱液， 冻干， 供质谱分析。

2.3 液相色谱-TripleTOF质谱分析

分离后冻干的多肽样品重新溶解于Nano-RPLC Buffer A中， 在线Nano-RPLC液相色谱在Eksigent nanoLC-UltraTM 2D系统（AB SCIEX）进行， 溶解后的样品以2 μL/min的流速上样到C18预柱（100 μm × 3 cm， 3 μm， 15 nm）上， 然后以相同流速冲洗脱盐10 min。分析柱是C18反相色谱柱（75 μm × 15 cm， 3 μm， 12 nm， ChromXP Eksigent）， 梯度洗脱：70 min内流动相B由5%升高至80%。质谱采用TripleTOF 5600 系统结合纳升喷雾III离子源（AB SCIEX， USA）， 喷雾电压为2.4 kV， 气帘气压为30 Psi， 雾化气压为5 Psi， 加热温度为150℃， 质谱扫描方式为信息依赖的采集工作模式下（Information Dependent Analysis， IDA）， 一级TOF-MS单张图谱扫描时间为250 ms， 每次IDA循环最多采集35个电荷为2+～8+， 且单秒计数大于100的二级图谱， 每张二级图谱的累积时间为80 ms。每次循环时间固定为2.5 s， 碰撞室能量设定为适用于所有前体离子碰撞诱导解离（CID）， 动态排除设置为11 s。

2.4 数据分析条件

质谱采集到的原始wiff图谱文件， 采用Protein Pilot Software 4.5软件进行数据加工处理和检索分析， 数据库为uniprot库中的Homo sapiens人种专一数据库（包含20210条蛋白质序列， 2015年1月2日下载）， 检索参数设置为非酶切、磷酸化修饰、氧化修饰强调和氨基酸取代， 假阳性率控制为1% FDR。

3 结果与讨论

3.1 两种不同分离方法分析结果的总体比较

如图1所示， 在相同的实验条件下， 采用Tips C18和LaGM两种分离方法所得到的多肽质荷比随时间分布图具有明显差异， 前者在前5 min和30 min的肽段数目较少， 多集中于10～20 min， 而且图1A中的数据点比图1B密集。 两种方法重复两次及删除重复项的结果列于表1。将两次测定结果合并后， 利用Zip-Tip C18方法共检测到了690条序列特异性肽段， 而利用LaGM方法检测到了507条肽段， 前者检测到的肽段数目比后者多， 这也与前者的前体离子数目约为后者两倍的结果一致。

将肽段总离子强度求和， Zip-Tip C18方法的总强度和肽段平均强度略高， 但在分析方法的误差范围之内[13]， 可视为无显著差异。两种方法的质荷比范围相近， 但Zip-Tip C18方法的分子量范围略宽。两种方法分离多肽两次测定的肽段重复数目分别是346和233条， 占总特异性肽段数目的比例分别是68%和63%。尽管Zip-Tip C18方法检出了更多的肽段数目， 但是在蛋白质水平上检出的数目少， 两次结果合并后只有38种蛋白质， 而LaGM方法则为44种。 此结果表明， 这两种方法的多肽组分布特征存在差异。

3.2 两种不同分离方法的结果在蛋白质水平的差异

由于多肽组产生于生物体内蛋白质的内源性降解， 首先在蛋白质水平上进行比较， 更能直观地反映两种方法的特性。在两种方法中检测到的共同蛋白质为21种（表2）。 Zip-Tip C18方法中， 归属于Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Statherin和Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2等蛋白质的肽段远多于LaGM方法， 而利用后者检测到了更多的归属于Histatin-1、Histatin-3和Protein S100-A8蛋白质的肽段。前期研究中， 利用LaGM方法在不同的样本中检测到的排名第一和第二的降解的蛋白质也是Histatin-1和Mucin-7[14]， 表明本方法的稳定性较好。由于同一分离方法两次平行实验的结果基本一致， 推测如此大的差异与肽段的性质相关， 而非来自于LC-MS 联用分析过程中的偶然误差， 分析结果的差异反映了两种方法对于不同肽段的分离富集能力存在差异。除了表2中的21种肽段归属蛋白， LaGM方法还检测到了其它22种唾液中的降解蛋白质（表3）， 但这些蛋白质大多只被检测到1条肽段， 它们的肽段数目之和为40条， 即低于8%的肽段分布在50%以上的蛋白质上， 并且信号强度也较低。这种肽段分布的不均性在血液多肽组中也可观察到[15]。

3.3 两种不同分离方法在肽段水平的差异

本研究将肽段序列相同但修饰不同的肽段视为两条特异性肽段， 这里的修饰包括磷酸化、氧化、蛋白质N端乙酰化和氨基酸取代等， 如LNEDVSQEESPSVISGKPEGRRPQ和其第6位丝氨酸的磷酸化是2条不同肽段。 利用Zip-Tip C18方法共检测到了690条肽段， 包括545条序列特异性肽段， 其中145条肽段上发生了修饰， 而利用LaGM方法检测到了507条肽段， 359条肽段为序列差异， 其中148条肽段发生了修饰， 两种方法序列完全相同的肽段有116条， 归属于21种蛋白质， 即虽然Zip-Tip C18方法比LaGM方法多检出183条肽段， 但对发现降解蛋白质的贡献并不大， 因为很多“新增肽段”归属于打分排名靠前的高丰度蛋白， 归属于前十位蛋白质的肽段占了总增加数目的84%以上。

二者在肽段分布特征和优势肽段构成上也不相同， Zip-Tip C18方法的平均肽段数目是22.25条/蛋白质， 而后者则为11.79条/蛋白质。Zip-Tip C18方法中， 前3条打分最高的蛋白质是Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B、Basic salivary proline-rich protein 1和Statherin， 对应的特异性肽段数目分别为130、102和91条; LaGM方法中前3种分最高的蛋白质是Histatin-1、Mucin-7和Uncharacterized protein C4orf40， 对应的特异性肽段数目分别为128、38和54条， 二者完全没有交集。值得注意的是， Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B在LaGM方法中只被鉴定到了19条肽段， 它们在Zip-Tip C18方法中均被检出。相反， Histatin-1在Zip-Tip C18方法中有83条肽段被检出， 但LaGM方法测到了128条肽段， 以上结果说明， Zip-Tip C18方法更易于富集Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B蛋白質的肽段， 而Histatin-1的肽段更易于被LaGM分离。

两种分离方法的结果虽然有差异， 但是存在阶梯序列和肽段在蛋白质水平上分布的不均一性是一致的。如唾液中肽段HSHREFPFYGDYGSNYLYDN的含量上升和GPGRIPPPPPAPY含量的下降被认为是慢性肾病的两种标志物[16]， 但是， 利用LaGM方法检测到63条含有该肽段的序列， 利用Zip-Tip C18方法则检测到了29条， 而含有GPGRIPPPPPAPY的肽段数目则分别是9条和53条。此外， 利用高分辨串联质谱方法检测到了一些质荷比和分子量非常相近的肽段， 如VISDGGDSEQF（m/z 577.254）与IDEERQGPPL（m/z 577.299）， QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGPG（N端焦谷氨酸化， m/z 741.720）和GPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPY（m/z 741.727）， MALDI-TOF质谱分析已表明样本处理影响分析结果的重现性 [17]， 而高分辨质谱可以给出更为精准的肽段序列信息， 因此， 可以更好地在肽段序列和蛋白质层面阐述分离方法对多肽组结果的影响。 尽管以分子量作为多肽组学生物标志物是目前应用较成熟的技术指标[18～20]， 但高分辨串联质谱方法可以提供更为精准的信息。

3.4 對差异肽段的比较分析

如上所示， Zip-Tip C18方法检测到的肽段数目多， 但肽段的归属蛋白较少， 而LaGM分离则发现了更多的降解蛋白质， 为阐明这种现象的原因， 对改变分离方法后增加的肽段进一步分析（表4）。

首先， 新检出肽段为原来肽段的降解肽段， 如肽段QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGPGFVPPPPPPPYGPGRIPPPPPAPYGPGIFPPPPPQP在两种方法中均能检测到， 但是Tips C18方法还检测到了此肽段进一步降解所产生的RGPYPPGPLAPPQPF、QRGPRGPYPPGPLAPPQPFG、QRGPRGPYPPGPLAPPQPFGP和VPPPPPPP等几十种短肽段。第二种情况为两种分离方法的结果在部分序列上存在重叠， 结果具有互补性。如肽段KFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQ及其降解肽段在两种方法中都可以被检出， 但两种方法的差别在于Tips C18方法中检出肽段SSEEKFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQ， 而LaGM方法检出KFLRRIGRFGYGYGPYQPVPEQPLYPQPYQPQYQQYTF， 即两种方法分别检测到了此肽段的N-端和C-端的延长肽段。第三， 尽管LaGM方法检测到的肽段数目总体较少， 但对某些蛋白质可以提供更多的肽段序列信息， 如Tips C18方法只检测到了炎症相关蛋白Protein S100-A8的一条肽段VWFKELDINTDGAVNFQEFLILVIKMGVAAHKKSHEESHKE， 但是利用LaGM方法不仅检测到该肽段， 还检测到多条包含该序列的相关肽段， 类似地， LaGM方法可在肽段AMVSEFLKQAW的基础上检测到肽段AMVSEFLKQAWF和AMVSEFLKQAWFI。也存在少数增加肽段序列不相关的情况， 如Tips C18方法检测到Actin蛋白的肽段SLSTFQQMWISKQEYDESGPSIVHRKCF， 而LaGM方法则检测到此蛋白的另外两条肽段MVGMGQKDSYVGDEAQSKRGILTL和NELRVAPEEHPVLL。最后， 特异性肽段的增加有时不体现在肽段序列的改变， 而是来自翻译后修饰和氨基酸残基的取代， 如Zip-Tip C18和LaGM方法中， 包含肽段DSHEKRHHGYRRKFHEKHHSHREFPFYGDYGSNYLYDN的特异性肽段的数目分别为4和22条， 这些差异肽段序列完全相同， 差异之处仅在于修饰不同， 除了原型肽段， 二者都观察到2、20和32位丝氨酸残基的磷酸化， 但是利用LaGM方法分离， 检测到了更多种磷酸化修饰的组合和氨基酸取代肽段， 在该肽段的N端和C端截短肽上也观察到了磷酸化修饰和氨基酸取代的现象（表5）。

4 结 论

唾液中的多肽成分非常复杂， 唾液多肽组的分析结果与分离方法密切相关， 不同分离方法可能导致肽段分布特征、优势肽段构成和归属蛋白质组成的差异， 仅采用一种分离方法不能代表多肽组的全部情况。 在多肽组学研究中， 应重视低丰度肽段和蛋白质的分离检测。

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Comparison of Two Different Separation Methods

for Analysis of Salivary Peptidome

KONG Xiang-Yi1， DU Jian-Shi1， XU Jin-Ling2， LI Shui-Ming2， WANG Yong2， ZHAO Qing*3

1（Lymphatic and Vascular Surgery Department， Xinmin Branch of China Japan Union Hospital，

Jilin University， Changchun 130033， China）

2（College of Life Science and Oceanography， Shenzhen Key Laboratory of Marine Bioresources

and Ecology， Shenzhen University， Shenzhen 518060， China）

3（Neurology Department， Nanhu Branch of China Japan Union Hospital， Jilin University， Changchun 130033， China）

Abstract Zip-Tip C18 solid phase extraction and oxide graphene-lanthanum phosphate nano composite （LaGM） were used to separate saliva peptides respectively. The peptides were identified by high-resolution tandem time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）. To reduce accidental errors， the MS analysis repeated once， and the results of two replicates were combined and then were compared at the peptide and protein levels respectively. A total of 545 sequence-specific peptides belonging to 38 proteins were detected by Zip-Tip C18 method， and 359 different peptides coming from 44 proteins were detected by LaGM method， and the two were coincident with 116 peptides （19 proteins）. Furthermore， it was found that the peptide distribution characteristics and the dominant peptide composition obtained by the two methods were significantly different. More peptides of Submaxillary gland androgen-regulated protein 3B， Statherin and Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 were enriched by Zip-Tip C18; more peptides of Histatin-1， Hisatin-3 and Protein S100-A8 were detected by LaGM method， and the conclusions were consistent after post-translational modification were included. This study showed that these two methods had a preference for the enrichment of peptides， e.g. the separation process may lead to the loss of some peptides， the possible missing peptides may be the sequence-related peptides， modification-related peptides， protein-related peptides or peptides coming from some other proteins， fortunately， the potential missing peptides were more likely to be related with the peptides that had been detected. This study suggested that it may be not appropriate to use the results of a single separation method to represent the entire peptidome， and although the LaGM method detected fewer peptides， it was more conducive to enrichment of low-abundance peptides， by which more information about degrading proteins could be obtained.

Keywords Peptididome; Zip-Tip C18; Oxide graphene-lanthanum phosphate nano composite magnetic beads; Saliva; High resolution tandem mass spectrometry