毒死蜱等10种农药多残留快速检测芯片研究

赵颖　王双节　柳颖　焦沙沙　邹茹冰　方一画　郭逸蓉　朱国念

摘 要 以醛基修饰的载玻片为固相载体，农药竞争抗原为包被抗原，胶体金为标记材料，抗农药单克隆抗体为识别元件，银增强试剂用于放大信号，建立了一种含有10对包被抗原与农药抗体组合的免疫芯片，可同时检测农产品中毒死蜱、三唑磷、克百威、噻虫啉、吡虫啉、多菌灵、异菌脲、涕灭威、甲氰菊酯和百菌清共10种农药。对胶体金标记探针、包被抗原与农药抗体组合等免疫芯片反应条件進行了优化。本方法对10种农药的检出限（IC20）达到1.49～15.72 μg/L，检测仅需1.5 h。将此芯片方法应用于水果（苹果）、蔬菜（黄瓜）以及茶叶（红茶）中的10种农药残留检测，其最低检出量可满足相应作物中的农药最大残留限量（MRL）检测要求，且此芯片检测方法具有较高的准确度和精密度，农药的添加回收率为82.1%～120.8%，批内相对标准偏差RSD≤10.4%， 批间RSD≤12.1%，与质谱仪检测结果的相关系数大于0.9591。本研究为农药多残留快速检测分析提供了技术支持，具有良好的实用价值。

关键词 农药多残留; 快速检测; 免疫芯片; 胶体金; 竞争反应

1 引 言

发展食品中农药残留的检测技术，对保障食品安全和消费者健康、保护生态环境具有非常重要的意义。常用的农药残留检测技术为色谱法、质谱法等仪器方法[1～6]，准确率高，可实现定性与定量分析，但其耗时长、检测成本高，对检测人员技能要求高，而农药残留快速检测技术可以弥补这些不足。常见农药残留快速检测方法包括酶抑制法和免疫分析方法。其中，酶抑制法已列入国家标准，但其检测对象仅限于有机磷及氨基甲酸酯类杀虫剂，这两类农药在农业生产中已较少使用，因而存在一定的局限性。免疫分析方法主要基于抗原抗体反应，其检测的农药范围比酶抑制法更宽，检测快速，特异性强，灵敏度高。

常见的免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）和免疫侧流层析试纸法。Liu等[7]建立了间接竞争性ELISA定量检测果蔬中苯醚甲环唑的方法，最低检出量达229 μg/kg; Ma等[8]建立了ELISA法检测蜂蜜样品中的吡虫啉和噻虫嗪残留，最低检出量为20 μg/kg 和5 μg/kg; Chen等[9]建立了量子点-链霉亲和素偶联物快速灵敏竞争荧光ELISA方法，用于饮用水中毒死蜱检测，灵敏度较常规ELISA提高了5.5倍。对于ELISA法，一种试剂盒通常只能检测一种或两种农药。随着胶体金、量子点、荧光微球等多种纳米材料被适为标记物，试纸免疫侧流层析法在农药残留检测中的应用研究日益增多[10]。Liu等[11]将胶体金试纸技术， 用于三唑磷和对硫磷农药检测，检测灵敏度分别为50和100 μg/L; Wang等[12]将量子点试纸技术应用于吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺农药检测，检出限为0.10～0.33 μg/L; Zhang等[13]将时间分辨免疫层析技术用于检测克百威，检出限达0.04～0.76 μg/L。虽然免疫层析试纸的制备成本低，便于携带，现场检测方便，但由于其空间局限性，一条试纸不易设置5条以上的测试线[14]，故一般检测农药的种类小于5种[15]。因此，亟需研发能实现更多种农药残留同时快速定性与定量检测的分析方法。

免疫芯片是以抗原-抗体特异性结合反应为基础的蛋白芯片，是将几个、几十个甚至更高通量的抗原或抗体微量化， 以点阵式高密度排列于载体芯片，通过特异性免疫反应捕获待测样品中的靶分子，检测靶分子的含量[16]。免疫芯片技术已应用于生物医学的疾病诊断、蛋白质功能鉴定、微生物致病菌鉴定方面，并逐渐拓展到环境监测、食品卫生与质量安全控制等方面[17]。近年来，免疫芯片技术已被用于小分子污染物的检测中，主要采用固定包被抗原的竞争免疫反应模式，使用的芯片载体有琼脂糖玻片、醋酸纤维膜和CD光盘，检测对象有兽药[18]、真菌毒素[19]、农药[20，21]等，但目标测试物通常不超过10种，且大都局限于环境水样的检测，尚未将免疫芯片技术应用于畜产品、农产品等复杂基质样本。 这可能是由于复杂样品基质对不同抗原-抗体反应的干扰程度不同，当多个免疫反应同时在均相统一的体系条件下进行，会影响个别反应的灵敏度，或者部分抗原-抗体有交叉识别现象。因此，目前关于农产品基质中农药多残留检测免疫芯片技术的报道较少。本课题组前期建立的基于金增强的间接竞争免疫芯片技术用于检测蔬果中呋喃丹等7种农药[22]，采用QuEChERS方法进行样品提取与净化，从而降低基质干扰，但该研究采用硝酸纤维膜为非共价结合吸附载体，包被抗原固定程度易受反应体系（如pH值、盐离子强度）的影响，且漂洗过程存在膜易破损、不便操作等缺点。

本研究选择玻片为载体，在其表面进行醛基修饰，将包被抗原以共价键结合固定于载体上，更加稳定，并建立了毒死蜱等10种常见农药多残留的免疫芯片检测方法。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

UV-2550紫外分光光度计（日本岛津公司）; PHS-3C pH计（上海雷磁环保工程公司）; Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）; Allegra 64R台式高速离心机（美国Beckman公司）; GB500-X芯片点样仪（爱尔兰PolyPico Technologies公司）; 图像扫描仪（日本EPSON公司）; Analysis Only 4100芯片数据分析软件（美国GenePix Pro公司）; Agilent 7000C气相色谱串联质谱仪（GC-MS/MS，美国Agilent公司）; 超高效液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS，美国Waters公司）。

氯金酸、柠檬酸三钠、N-羟基丁二酰亚胺、1-（3-二甲基氨丙基）-3-乙基碳二亚胺、牛血清白蛋白（BSA）、鸡卵清白蛋白（OVA）、银增强液A和银增强液B、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙二醇（PEG）、邻苯二胺（OPD）、N-丙基乙二胺（PSA） （美国Sigma-Aldrich公司），其它试剂均为分析纯（国药集团化学试剂公司）。脱脂奶粉（上海光明乳业公司）; 8 mg/mL羊抗鼠IgG（二抗，上海捷宁生物公司）; 琼脂糖（北京Solarbio公司）; 芯片围栏（北京博奥生物公司）; 载玻片（浙江同力信息科技公司）。实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）。

毒死蜱、三唑磷、甲氰菊酯、克百威、噻虫啉、吡虫啉、百菌清、多菌灵、涕灭威、异菌脲标准品（100 μg/mL， 中国农业科学院天津环境保护科研监测所）; 百菌清、多菌灵、涕灭威、异菌脲的包被抗原和农药相应的抗体购于无锡杰圣杰康生物科技有限公司，其它包被抗原和农药相应的抗体由本实验室制备。

苹果、黄瓜、红茶样品购于本地超市。

2.2 醛基玻片制备

载玻片先用超纯水清洗，再将其完全浸没于食人鱼刻蚀液（98% H2SO4-30% H2O2=3∶1，V/V）， 80℃处理40 min， 然后用超纯水清洗3次，氮气吹干。

将氨基硅烷化后的玻片放入含3%～4%（V/V） 戊二醛的磷酸盐缓冲溶液（PBS， 0.01 mol/L，pH 7.4）中，室温下浸泡2 h，取出后先用PBS清洗3次，然后用超纯水漂清洗3次，氮气吹干，于4℃干燥保存，备用。

2.3 胶体金及金标二抗探针的制备

以金标二抗为信号探针，采用经典的柠檬酸三钠还原法制备20 nm 胶体金[23]用于标记二抗。采用盐沉淀法和吸光度法，进行胶体金标记体系pH值和最适标记量优化[24]。在二抗标记浓度为80 mg/L条件下，用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金溶液pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5，篩选最适标记pH值; 在最适pH条件下，进行胶体金最适标记量优化，分别设置10、20、40、80和100 mg/L的二抗标记浓度，筛选最适标记量。按照文献[24]的方法，在最适条件下，制备金标二抗探针。

2.4 芯片点样与检测方法

（1）点样 将各农药包被原用30%甘油-0.05 mol/L CBS （pH 9.6）缓冲液稀释后，用微量点样仪点样包被于醛基化玻片上（3 nL/点，冷冻干燥 2 h），10种农药包被抗原在醛基玻片上的排布阵列如图1所示; （2）芯片围栏分区 将芯片围栏黏贴在相应的区域，0.05% Tween-20-0.01 mol/L PBS （PBST）洗涤2次; （3）封闭 5%脱脂奶粉-PBS，100 μL/孔，37℃ 孵育30 min，PBST洗涤2次; （4）一抗反应 加入抗体和待测样品（农药标准品或水果、蔬菜、茶叶等提取液）， 10种抗体稀释液和待测样品各25 μL/孔， 振荡混匀后，37℃孵育30 min， PBST洗涤2次; （5）金标二抗反应 加入金标二抗20倍稀释液（100 μL/孔），37℃孵育30 min，用PBST和超纯水各洗涤1次; （6）银增强反应 加入银增强A液和B液等体积混合液，100 μL/孔，室温孵育15 min，超纯水洗涤2次; （7）芯片扫描 将芯片置于图像扫描仪进行扫描成像，用Adobe photoshop 7.0.1生成16位灰度图，将所得图片置于芯片数据分析软件中获得每个检测区域的信号值，用于定量计算; （8）数据分析 采用芯片数据分析软件计算每个检测点的信号值和背景值，扣除背景值后得到相对信号值。抑制率（Inhisition rate （%））的计算见公式（1）：

I（%）={（S_b-S_s）/S_b}×100%（1）

其中，I为抑制率， S_b为空白样品的信号值; S_s为检测样品的信号值。

以抑制率为纵坐标，农药浓度对数为横坐标绘制标准曲线，并计算抑制率IC₅₀。

2.5 实际样品分析

用甲醇将毒死蜱等10种农药标准品进行梯度稀释，将农药混合标样分别添加于黄瓜、苹果、红茶空白样品（经质谱仪检测，毒死蜱等10种农药的初始残留量均小于仪器检测限）中。

芯片检测：采用简化的QuEChERS法[21]对待测样品进行快速前处理。称取水果、蔬菜样品10 g（茶叶样品 1 g，加入10 mL超纯水浸泡10 min），加入10 mL乙腈，振荡提取3 min，加入1 g NaCl和5 g无水MgSO4，振荡提取3 min，4000 r/min离心5 min。取5 mL上清液，加入0.1 g PSA，静置30 min后，吸取 2 mL 上清液，氮气吹干，用反应缓冲液（20%甲醇-PBS）定容，过0.22 μm有机滤膜后待测。采用2.4节的方法进行测定。

仪器检测：黄瓜、苹果和红茶样品中10种农药残留的前处理与检测方法参照中华人民共和国农业行业标准NY/T761-2008[25]，其中噻虫啉、多菌灵、吡虫啉和涕灭威4种农药用UPLC-MS/MS检测，其余6种农药用GC-MS/MS检测。

3 结果与讨论

3.1 芯片的包被抗原与农药抗体工作浓度优化

采用10组包被抗原-农药抗体组合，分别为毒死蜱-OVA，三唑磷-OVA，克百威-OVA，噻虫啉-OVA，吡虫啉-HRP，多菌灵-BSA，异菌脲-BSA，涕灭威-BSA，甲氰菊酯-BSA，百菌清-BSA和相应的农药抗体组合，一个阵列组合中包含以上10种包被抗原，一张玻片包含7个阵列组合。免疫芯片反应过程如图2所示。

为实现各组包被原-抗体反应均获得较高的信号响应、灵敏度和特异性，根据芯片检测点的扫描分析数据，最终确定芯片中包被抗原-农药抗体工作浓度。其中，包被抗原在免疫芯片上的点样浓度为0.02～1.00 g/L， 一抗浓度为0.20～5.00 mg/L; 将50 mg/L二抗用于胶体金标记，反应时金标探针稀释20倍。优化得到包被抗原-农药抗体组合浓度见表1。

3.2 免疫芯片方法的分析性能

采用10种农药的系列标准溶液进行测试，通过芯片扫描仪成图并获取信号值进行定量分析，得出10种农药的抑制中浓度（IC₅₀）、标准曲线方程（R2>0.96）和线性范围见表2，芯片测试扫描图见图3。

结果表明，以醛基玻片为固相载体构建的免疫芯片方法，对各农药的IC₅₀与采用同样包被抗原和农药抗体建立的间接竞争ELISA方法对各农药的IC₅₀相当，且接近于本研究组前期建立的膜芯片法[22]。本方法以IC₂₀为检出限，以黄瓜中毒死蜱农药残留为例，其IC₂₀=1.31 μg/L，黄瓜样品提取需要10倍稀释，则理论最低检出量为13.1 μg/kg，可满足黄瓜中毒死蜱最大残留限量100 μg/kg的检测要求[26，27]; 同理，其它9种农药的最低检出量也可满足黄瓜中MRL检测要求。

3.3 样品的基质效应

免疫芯片用于检测苹果、黄瓜、红茶样品中的10种农药，需首先考察样品基质对检测结果的干扰程度，通常采用样品稀释法降低基质效应。本研究采用简化的QuEChERS法对待测样品进行提取、净化、浓缩和定容，根据最终定容体积可计算出样品基质的稀释倍数。设置样品稀释系列梯度（1、10、20和40倍），进行各基质不同稀释倍数下的10种农药的芯片法检测，实验结果表明，黄瓜样品稀释10倍，苹果和茶叶样品稀释20倍，其基质干扰可忽略，不影响方法的检出限。因而，样品提取净化后取2 mL上清液，氮气吹干，黄瓜样品采用20 mL的反應缓冲液定容（10倍稀释），苹果和茶叶样品采用40 mL的反应缓冲液定容（20倍稀释）。以蔬菜样品（黄瓜）为例，其添加回收率及批内批间差异见表3。苹果、黄瓜、红茶样品的添加回收率为82.1%～120.8%，批内相对标准偏差（RSD）为2.1%～14.8%，批间RSD为3.6%～12.1%，表明基于醛基玻片的农药多残留检测方法具备良好的准确度和精确度，符合农药残留分析的要求，且检测灵敏度符合3种农产品的MRL要求（MRL数值见电子版文后支持信息中附表）。

3.4 芯片法与仪器法检测结果的相关性

分别使用免疫芯片方法和液（气）相色谱-质谱联用仪器方法检测苹果、黄瓜、红茶样品上10种农药添加回收量（表3）， 将两种检测结果进行相关性分析，得到线性回归方程，苹果： y=1.0419x-0.9035，R2=0.9730; 黄瓜： y=1.0037x+2.4689， R2=0.9741; 红茶： y=1.0046x+7.2808， R2=0.9591。 结果表明，免疫芯片分析方法和质谱分析方法对10种农药的检测结果具有良好的相关性，两种检测方法对黄瓜样品检测的相关性曲线见图4。

4 结 论

建立了农药多残留免疫芯片检测体系，并应用于三类农作物和水果（苹果）、蔬菜（黄瓜）、茶叶（红茶）中毒死蜱等10种常见农药残留的快速筛查，而且有望应用于其它农产品的农药残留检测。与传统农药残留仪器检测方法相比，此芯片方法具有成本低、前处理方法简单、检测快速、检测农药种类相对较多等优势。

References

1 ZHOU Li， LUO Fen-Jian， ZHANG Xin-Zhong， JIANG Ya-Ping， LUO Zheng-Yun， LIU Guang-Ming， CHEN Zong-Mao. Journal of Instrumental Analysis， 2014， 33（6）： 642-647

周 利， 罗逢健， 张新忠， 姜亚萍， 楼正云， 刘光明， 陈宗懋. 分析测试学报， 2014，  33 （6）： 642-647

2 ZHU Pan， MIAO Hong， DU Juan， ZHAO Yun-Feng， WU Yong-Ning. Journal of Food Safety and Qualityy，  2013，  4（1）： 3-10

朱 盼， 苗 虹， 杜 娟， 赵云峰， 吴永宁.  食品安全质量检测学报，  2013，  4 （1）： 3-10

3 LIU Yong-Qiang， LIU Sheng， XU Wen-Juan， TIAN Guo-Ning， ZHANG Jin-Ling. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（9）： 941-948

刘永强， 刘 胜， 许文娟， 田国宁， 张金玲. 色谱， 2017， 35（9）： 941-948

4 LIANG Xiu-Mei， WANG Xiang-Yun， XUE Xiao-Feng， QI Pei-Pei， LIU Zhen-Zhen， LIU Zhi-Wei， ZHOU Li， WANG Xin-Quan， WANG Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（4）： 553-559

梁秀美， 王祥云， 薛晓锋， 齐沛沛， 刘真真， 刘之炜， 周 莉， 王新全， 王 强. 分析化学， 2017， 45（4）： 553-559

5 QU Li， LI You， ZENG Jing， SHENG Yong-Gang， YI Xiong-Hai， CHENG Jia. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（7）： 778-784

曲 栗， 李 优， 曾 静， 盛永刚， 伊雄海， 程 甲. 色谱， 2017， 35（7）： 778-784

6 GAO Yang， XU Ying-Ming， SUN Yang， QIN Xu. Journal of Agricultural Resources and Environment，  2014，  31（2）： 110-117

高 阳， 徐应明， 孙 扬， 秦 旭.  农业资源与环境学报，  2014，  31（2）： 110-117

7 Liu B， Feng J H， Sun X， Sheng W， Zhang Y， Wang S. Food Anal. Method， 2018，  11（1）： 119-127

8 Ma H X， Xu Y J， Li Q X， Xu T， Wang X T， Li J. Food Addit. Contam. A， 2009，  26： 713-718

9 Chen Y P， Ren H L， Liu N， Sai N， Liu X Y， Liu Z， Gao Z X， Ning B A. J. Agric. Food Chem.， 2010，  58（16）： 8895-8903

10 SI Fang-Fang， GUO Yi-Rong， ZHAO Ying， GUI Wen-Jun， WANG Meng-Cen， ZHU Guo-Nian. Chinese Journal of Pesticide Science， 2017，  19（4）： 409-417

司芳芳， 郭逸蓉， 赵 颖， 桂文君， 王蒙岑， 朱国念.  农药学学报，  2017，  19（4）： 409-417

11 Liu B B， Gong H， Wang Y L， Zhang X S， Li P， Qiu Y L， Wang L M， Hua X D， Guo Y R， Wang M H， Liu F Q， Liu X J， Zhang C Z. Anal. Methods， 2018，  10（4）： 422-428

12 Wang S J， Liu Y， Jiao SS， Zhao Y， Guo Y R， Wang M C， Zhu G N. J. Agric. Food Chem.， 2017，  65（46）： 10107-10114

13 Zhang Q， Qu Q Y， Chen S S， Liu X W， Li P W. Food Chem.， 2017，  231： 295-300

14 Dzantiev B B， Byzova N A， Urusov A E， Zherdev A V. TrAC-Trend. Anal. Chem.， 2014，  55： 81-93

15 LIU Fu-Xin， DOU Xiao-Wen， YANG Zhi-Xin， LI Qian， LUO Jiao-Yang， FAN Zhuo-Wen， YANG Mei-Hua. China Journal of Chinese Materia Medica， 2017，  42（16）： 3056-3064

劉复新， 豆小文， 杨志欣， 李 倩， 骆骄阳， 范卓文， 杨美华.  中国中药杂志，  2017，  42（16）： 3056-3064

16 KANG Xi-Xiong. Qilu Medical Examination， 2005，  （06）： 1-3

康熙雄.  齐鲁医学检验，  2005，  （06）： 1-3

17 HUANG Qiang-Li， MIN Cheng-Jun， FAN Qiang-Sheng， WEI Xing-Hua. Meat Industry， 2013，  （02）： 46-48

黄强力， 闵成军， 凡强胜， 魏星华.  肉类工业，  2013，  （02）： 46-48

18 Gao Z X， Liu N， Cao Q L， Zhang L， Wang S Q， Yao W， Chao F H. Biosens. Bioelectron.， 2009，  24（5）： 1445-1450

19 Wang Y， Liu N， Ning B A， Liu M， Lv Z Q， Sun Z Y， Peng Y， Chen C C， Li J W， Gao Z X. Biosens.Bioelectron， 2012，  34（1）： 44-50

20 Dobosz P， Morais S， Bonet E， Puchades R， Maquieira A. Anal. Chem.， 2015，  87（19）： 9817-9824

21 Desmet C， Blum L J， Marquette C A. Anal. Chem.， 2012，  84（23）： 10267-10276

22 Lan M J， Guo Y R， Zhao Y， Liu Y， Gui W J， Zhu G N. Anal. Chim. Acta， 2016，  938： 146-155

23 ZHAO Ying， YANG Bin， LIU Ying， FANG Yi-Hua， SI Fang-Fang， GUO Yi-Rong， CHENG Jing-Li， ZHU Guo-Nian. Chinese Journal of Pesticide Scienc， 2016，  18（3）： 337-343

赵 颖， 杨 斌， 柳 颖， 方一画， 司芳芳， 郭逸蓉， 程敬丽， 朱国念.  农药学学报，  2016，  18（3）： 337-343