铅锌矿区不同程度尾矿砂重金属污染土壤的纵向微生物群落结构分析

蒋永荣，梁英，张学洪*，秦永丽，伍婵翠，李学军

1. 桂林电子科技大学生命与环境科学学院，广西 桂林 541004；2. 桂林电子科技大学后勤处，广西 桂林 541004

尾矿砂是金属矿石或者煤炭经加工浮选后产生的废弃物，是土壤重金属污染的主要来源物之一（吴天一，2013）。尾矿砂中的重金属受到雨水冲刷后，较易迁移到周围土壤和水体中，对农作物以及人体健康产生威胁（Conesa et al.，2007）。程强等（2013）研究发现，黎河两岸堆积的铁尾矿砂每逢降雨便被冲至黎河内并最终堆积在于桥水库底泥中，造成水库铁含量偏高，库容减少。因此尾矿砂需建专门的尾矿库进行贮存管理，以降低其环境风险。但有资料统计，1960—2015年全球范围内的尾矿库因建设和管理不规范，发生了 60余起尾矿库溃坝事件，造成严重的环境污染（Liu et al.，2015）。2015年发生的撒马尔科密纳考萨（Samarco Mineracao SA）大坝泄漏，是迄今为止报道的最大的尾矿坝溃坝事件，导致3500多万m3的矿渣顺山坡滑落（Hatje et al.，2017）。上世纪70年代，桂林阳朔县思的村附近的一座铅锌尾矿库在一次强降雨中发生了坝体垮塌，大量的尾矿砂沿河谷倾泻进入思的村农田内，对当地的土壤带来了严重的重金属污染（胡清菁等，2014）。此事件引起了多名研究者的关注，研究者现场调查发现该地土壤总 Cd为24.5 mg·kg-1，所产早稻Cd含量为国家标准的3倍，晚稻Cd含量则超过国家标准5倍（林炳营，1997）；该地区土壤中Pb、Zn和Cu时空差异十分显著（李强等，2014），其中土地利用类型是该地区重金属污染空间分布不均匀最主要的驱动力（胡清菁等，2014）。

目前针对阳朔县思的村铅锌尾矿库溃坝事件的研究，多围绕尾矿砂溃坝带来的重金属污染分布情况方面，但未见该地区尾矿库溃坝重金属污染对当地土壤微生物群落结构影响的报道，更未见其土壤纵向微生物群落结构的报道。然而，土壤微生物群落结构是表征土壤生态系统稳定性的重要参数，与土壤重金属污染之间的关系一直是生态学以及环境科学领域研究的热点问题（刘云国等，2007；王秀丽等，2003）。Ghosh et al.（2018）利用16S RNA研究了富锰尾矿砂中微生物群落结构，对研究锰尾矿砂微生物多样性以及锰在自然化学循环中的作用具有重要意义；景炬辉等（2017）分析了中条山十八河尾矿废弃地不同恢复阶段（1—45 a）的细菌群落结构，发现不同恢复年限的土壤中的微生物群落结构差异显著，土壤理化因子以及重金属含量是细菌群落结构变化的关键因素。值得注意的是，土壤纵向微生物群落分布更能反映微生物沿土壤深度对重金属的适应性，这对原位微生物强化修复重金属污染土壤具有重要的参考价值。

因此，为了探究阳朔县思的村尾矿库溃坝后重金属污染对土壤微生物群落结构的影响，以受尾矿砂重金属污染的思的村河谷岸边、柑橘园以及水稻田土壤3个取样点表层土壤（0—20 cm）、浅层土壤（20—40 cm）、中层土壤（40—60 cm）以及深层土壤（60—80 cm）为研究对象，探究土壤纵向的Pb、Zn、Cu和Cd含量以及潜在的生态风险，土壤纵向的微生物群落多样性，土壤纵向微生物优势菌属及其与土样重金属含量之间的关系，以期为铅锌矿尾矿砂重金属污染土壤的微生物修复提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

受铅锌尾矿砂污染的思的村区域（24°58′N，110°33′E）位于广西桂林市阳朔县东北方向。该地平均海拔150 m，为亚热带季风气候，年平均温度28.5 ℃，年平均降水量1000—2000 mm，所种植的农作物主要以水稻、玉米与柑橘为主。思的村区域处于西南岩溶地质区内，矿产资源丰富。上世纪50年代探明思的村的东北方向存在一座铅锌矿，随即进行开采并建立了一座矿石浮选厂。所采的矿石以闪锌矿、方铅矿为主，且有少量的黄铁矿以及黄铜矿，经过氢氧化钙等碱性化学药剂浮选后的尾矿矿渣中存在Pb、Zn、Cu和S等物质（覃朝科等，2005）。然而在上世纪70年代的一次强降雨中，尾矿砂库大坝坍塌，大量的尾矿砂泻入思的村农田内。当地居民将含有尾矿砂的农田进行深翻平整后，继续耕种，造成严重的土壤重金属污染。

1.2 样品采集及分析方法

本研究采集的土样来自：（1）尾矿砂坝坍塌冲刷形成的河谷岸边（24°59′N，110°33′E，高度 233 m）；（2）距离河谷 800 m 的柑橘园（24°58′N，110°37′E，高度 239 m）；（3）距离河谷 2000 m 的村边水稻田（25°33′N，110°24′E，高度 231 m）的3个采样点，分别用G、M和L表示；在各采样点垂直深度为 0—20、20—40、40—60、60—80 cm处采集样品，在每个采样深度处随机选择3个位置采集等量土壤，然后进行均匀混合，作为该采样深度土壤的混合样品，分别表示为 G1—G4、M1—M4和L1—L4，共12个样品。所有样品均采集于2018年1月15日，一部分置于密封袋中放入4 ℃的冰盒中，运回实验室后置于-80 ℃冰箱保存，进行微生物群落结构分析；另一部分常温置于样品盒中，带回实验室用于理化性质分析。

土壤的pH用无CO2水对土壤进行浸提后直接用pH计测定，浸提时水与土壤质量之比为2:5；总氮（TN）、总碳（TC）和总硫（TS）含量用元素分析仪（Elementar Vario MACRO，Germany）测定；土壤中Pb、Zn、Cu、Cd含量使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）仪（PerkinElmer，NexION 300X）测定。

1.3 样品DNA提取及测序

使用土壤试剂盒（Power Soil，MoBio）对各样本的DNA进行提取；提取DNA后，采用细菌高变区 V3-V4区 16S RNA通用引物：正向 341 F（5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′），反向 806 R（5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′）进行 PCR扩增；PCR产物进行电泳检测后，采用qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收产物中的目的条带；回收后由北京诺禾致源生物信息科技有限公司使用 lon S5XL进行16S rRNA高通量测序，并进行kingdom（界）、phylum（门）、class（纲）、order（目）、family（科）和genus（属）分类水平的物种注释分析（设定阈值为0.8—1）。

1.4 土壤重金属污染与影响评价方法

目前常用的重金属污染与影响评价方法为Hakanson提出的潜在生态危害指数法。此法考虑了不同重金属物质的毒性系数，将重金属含量与其生态效应以及毒性效应相联系，以评价土壤中单种重金属污染物的生态影响以及多种污染物的复合生态影响。单种重金属的潜在生态危害系数Ei与重金属综合潜在生态风险指数 RI的计算公式分别如式（1）与式（2）所示：

式中，Ti、Ci和Si分别为重金属i的毒性响应系数、土壤样品中的含量以及参考值，Ti选用标准化重金属毒性响应系数：TPb为5，TCu为5，TZn为1，TCd为 30（Jafarabadi et al.，2017）；Si选取广西土壤重金属含量背景值：SPb为24.0 mg·kg-1，SCu为27.8 mg·kg-1，SZn为 75.6 mg·kg-1，SCd为 0.267 mg·kg-1。Ei与RI值的污染程度分级标准如表1所示。

表1 Ei与RI的分级标准Table 1 Rank of Ei and RI

1.5 数据分析方法

物种多样性一般可由 Alpha指数即 Chao1指数、ACE指数、Shannon指数以及Simpson指数（1—D）表示；其中Chao1指数和ACE指数反映群落物种丰富度，Shannon指数以及Simpson指数反映群落物种的均匀性（杜聪等，2018）。由于Chao1指数、ACE指数、Shannon指数以及Simpson指数的计算方法不同，为了能够统一表达各指数的变化情况，对土样各指数值进行 0—1标准化。此外，为了能够清楚表达菌属在各土样中的变化趋势，对土样中相对丰度最高的30个菌属（top30菌属）的相对丰数值也进行0—1标准化。

利用变异系数（CV）对土样重金属含量差异性进行分析，CV的分级情况一般为：当变量的CV＜0.1时视为弱变异，0.1≤CV≤1.0时视为中等变异，≥1.0时视为强变异（刘晓林等，2012）。利用冗余分析（RDA）探究土样微生物菌属与重金属含量之间的相关关系。RDA是一种基于线性模型的约束性直接梯度排序方法，能够在同一张图中表达出每个解释变量（土样重金属含量）对响应变量（土样理化性质或土样微生物菌属）变化的贡献率（史晓凯等，2018）。

2 结果与讨论

2.1 土样重金属含量以及理化性质的关系

2.1.1 土样重金属含量以及潜在的生态危害

各土样的重金属含量如表2所示，可知Pb、Zn、Cu和Cd在距尾矿砂坝坍塌冲刷形成的河谷0、800、2000 m的岸边（G）、柑橘园（M）和水稻田（L）土壤中的含量逐渐降低。由Pb、Zn、Cu和Cd的变异系数CV可知，各类重金属含量在纵向上均呈现中等变异性，整体而言：Pb、Zn和Cd变异性较强，而Cu的变异性较弱；各重金属纵向变异性在不同取样点也有所差别，河谷岸边的土壤金属纵向变异性最大，而水稻田土壤金属纵向变异性最小。由此可知，该地区土壤中的重金属存在明显的纵向迁移现象，重金属污染越严重的土壤中的重金属纵向迁移就越明显。

由表 2可知，重金属的潜在生态危害指数Ei在河谷沿岸、柑橘园与水稻田土壤中也逐步降低，由公式（1）可知Ei的纵向迁移规律与重金属含量纵向迁移规律相同。重金属生态影响方面，河谷沿岸各垂直深度土壤层中的Pb、Zn、Cu和Cd的潜在生态危害较大，均在中等危害水平以上；柑橘园各垂直深度层中的Zn和Cu的潜在生态危害较小，为轻度危害水平，而Pb和Cd潜在生态危害较大，在中等危害水平以上；水稻田各垂直深度土壤层中的Pb、Zn和Cu的潜在生态危害小，均为轻度危害水平，而Cd的潜在生态危害较大，在中等危害水平以上；综上，各取样点土壤Cd的潜在生态危害都十分突出，Cd污染是该地区最主要的重金属污染。

表2 土样重金属含量及其潜在生态危害指数Table 2 Concentration and potential ecological hazard index of Soil heavy metal

2.1.2 土样理化性质及其与重金属含量的相关关系

土壤样品的各理化指标参数如表3所示。由表3可知，MC和pH的变异系数接近或小于10%，说明各取样点不同深度处的MC和pH差别不大；而TC、TN与TS的变异系数较大，说明不同取样深度处的TC、TN与TS存在较大的差别。为探究重金属含量对土壤理化性质的影响，对土壤的重金属含量以及理化参数进行RDA分析，结果如图1所示。由图 1可知，Cu、Pb之间呈现出极为显著的正相关性，而他们与Zn的正相关性较弱，与Cd的正相关性进一步减弱，这种相关性规律与他们的毒性响应参数大小规律较为一致。由图 1可知，MC以及TS和各类重金属均表现出显著的负相关关系；分析认为硫是微生物生长所需的营养元素，也是作物生长所必需的营养元素（康学辉等，2016），而重金属含量越高导致土壤中的硫素越易流失，不利于微生物以及作物的生长。TN以及TC两者与Cu、Pb和 Zn存在一定的正相关关系；Aceves et al.（1999）在受Pb和Zn污染的土壤中发现了C的积累，Labanowski et al.（2007）认为土壤中较高含量的重金属抑制了微生物的活性从而可造成有机碳的积累，Dai et al.（2004）研究认为土壤中重金属含量过高，会抑制N的转化，造成土壤中的N的积累，与本研究的现象相符。pH与各类重金属之间存在着正相关关系，有研究指出土壤pH对重金属的转移有重要影响，pH越高，迁移性变弱，重金属越容易被土壤吸附（Yong et al.，2007）。

2.2 土样的微生物群落结构及与重金属含量之间的变化规律

2.2.1 基于Alpha指数的土样微生物群落物种多样性分析

图1 土壤重金属含量与理化性质之间的RDA分析Fig. 1 Redundancy analysis between heavy metal content and physicochemical properties of samples

图2 土样的Alpha指数Fig. 2 Alpha index of soil samples

各土壤样品微生物群落 Alpha指数如图 2所示，G取样点的Alpha指数随着取样深度的增加而显著下降，而M和L点的Alpha指数并没有较为明显的纵向变化规律。然而不同取样点之间，河谷岸边0—20、20—40、60—80 cm的土壤样品G1、G3与 G4的 Alpha指数分别小于柑橘园土壤样品M1、M3和M4以及水稻田土壤样品L1、L3和L4。L1的Alpha指数最高，M2和M3的Alpha指数次之；分析认为，植物发达的根系共生有多种微生物，一方面可减轻重金属对植物的毒害作用，另一方面增加了土壤微生物的物种多样性（丁巧蓓等，2016；李海燕等，2017）；水稻根系主要集中在0—20 cm深度的表层土壤中（张亚洁等，2017），而柑橘树根系主要集中在20—60 cm深度的浅层以及中层土壤中（唐广田等，2014；张翰林等，2017），恰好分别是L1以及M2与M3所处的深度范围，这表明水稻以及柑橘树根系分布增加了土壤微生物的多样性，从而影响了各采样点微生物群落物种多样性纵向分布。

表3 土样理化指标Table 3 Physicochemical properties of samples

2.2.2 门和科分类水平上的土样微生物群落结构组成

门分类水平，3个采样点的群落结构在纵向上没有表现出明显的差异，变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）和绿弯菌门（Chloroflexi）6个菌门均占据主导地位，相对丰度之和达87.9%以上，如图3所示。其中，变形菌门、厚壁菌门与放线菌门在除 L1外的土样中属于优势菌门，三者相对丰度之和超过了70.0%；多个研究指出这三类菌门微生物在受尾矿重金属污染的土壤内普遍占优势，说明这三类菌门可适应重金属污染环境，并可能可以通过自身代谢降低重金属的毒性（Bier et al.，2014；Kamika et al.，2013）。拟杆菌门在水稻田采样点L中相对丰度较高，在表层土壤中相对丰度更是高达16.37%，由于水稻田重金属仅具有低潜在生态风险，所以拟杆菌门可能对重金属毒性较为敏感，难以适应高重金属污染环境。酸杆菌门在表层土壤L1以及M1中相对丰度较高，分别为16.4%和11.2%；酸杆菌门中的细菌可耐受一定程度的重金属污染，将复杂的有机碳转化为乙酸等短链脂肪酸从而使得土壤环境呈现酸性（Eichorst et al.，2007；Noah et al.，2007）；此外，其他异养微生物可能利用酸杆菌代谢的乙酸作为能源物质进行生长，从而增加土壤微生物多样性。绿弯菌门细菌在各土样中均有存在，且相对丰度波动不大，基本处于4%—7%之间；研究表明，绿弯菌门细菌可以通过光合异养、光能自养和化能自养等多种营养途径进行生长，能在重金属污染环境中稳定生存（Nuria et al.，2008；刘晋仙等，2017）。

图3 门分类水平上土样微生物群落组成Fig. 3 Microbial community of soil samples at the level of phylum

图4 科分类水平上土样微生物群落组成Fig. 4 Microbial community of soil samples at the level of family

各土样微生物群落中，相对丰度最高的 10个科如图4所示；除M1和L1以外，这10个科的相对丰度之和均达50%以上。Xanthomonadaceae在G及L倾向于分布在较深的土壤层（G4以及L4），而在L点倾向于分布在较浅的土壤层中，但在L点各垂直深度土壤中相对丰度均高于G与M取样点；分析认为 Xanthomonadaceae中存在具有反硝化能力的菌属，能将土壤中的硝态氮还原成氮气，水稻田经常使用氮肥，故给这种反硝化菌的生长提供了条件（王子凌等，2018）。Alicyclobacillaceae是嗜酸嗜热的脂环酸芽胞杆菌科（刘波等，2015；岳田利等，2008），在受重金属污染严重的G点各垂直深度土壤层中均具有较高的相对丰度；分析认为该科微生物能产芽孢，可能具有耐受重金属污染的能力，故可对该科菌种资源进行开发，找到能够耐受和改善土壤重金属污染的微生物。Oxalobacteraceae在G点较浅的土壤中（G1—G2）以及M点较深的土壤中（M2—M4）中相对丰度较高，有资料指出，该科中存在一些能在重金属污染的土壤中生长微生物，且对减轻植物根系的铜毒以及土壤氮循环有重要作用（Feng et al.，2012；Gaspar et al.，2015）。Sphingomonadaceae为M和L取样点的优势科，尤其是倾向于分布在浅层以及中层土壤中，有研究指出该科中的微生物细胞存在特殊结构，能在极端条件下生存（韩睿等，2016）；然而该科在受尾矿砂污染严重的G点相对丰度较小，说明该科中的微生物耐重金属毒性可能不强。除此10个科外，L点表层土壤（L1）还存在着硫酸盐还原菌科（Desulfurellaceae），其相对丰度高达 2.5%；有研究指出微生物在还原硫酸盐的同时，可将土壤中的部分重金属转化为惰性金属硫化物，这有利于减缓重金属对水稻的毒害作用（Cornu et al.，2007）。所以，可从水稻田表层土壤中筛选出一些能耐受重金属的硫酸盐还原菌（Sulfate Reducing Bacteria，SRB)，为 SRB法钝化修复土壤重金属污染提供菌种资源（范文宏等，2008）。

2.2.3 属分类水平上的土样微生物群落结构及其与重金属含量的关系

top30菌属在各土样相对丰度的变化如图5所示，它们能够反映各采样点微生物群落纵向组成差异。除M1和L1外，其他土样的top30菌属的相对丰度之和大于 57%；由图 1的 Shannon指数以及Simpson指数曲线可知M1和L1物种均匀度较高，所以top30菌属在群落中的比重及对群落结构的影响也较小。由图5发现，各土样的top30菌属相对丰度差别较大，纵向分布极其不均匀，部分菌属只在某取样点的某深度层出现或在某采样点某深度层的相对丰度显著高于其他土样中的相对丰度，如：Paucimonas和Luteibacter分别仅在G1和G4中出现，Paraburkholderia在G3中的相对丰度显著大于其他土样。分析认为，各土样长期受到不同程度的重金属污染，所以其微生物菌属结构组成纵向差异较大。

为研究土壤纵向微生物优势菌属与土样重金属含量之间的关系，对 top30菌属及重金属含量进行RDA分析，如图6所示。各重金属因子的相关关系上，Cd与Zn之间具有极强的正相关性；Cd与Pb以及Cd与Cu的正相关性也比较显著，这说明Cd、Zn、Pb与Cu在影响土样菌属结构方面有协同作用。菌属与重金属含量的关系上，由图可见，超过半数的菌属与重金属含量之间存在较强的负相关关系；Paraburkholderia(Burkholderia-Paraburkholderia)、Ramlibacter、Bacillus、Pseudarthrobacter、Pseudoduganella、H16和Nitrososphaera7个菌属与土样重金属含量之间相关关系几乎接近于0，这些菌属也可能存在着重金属抗性，如王磊（2017）在受汞污染的土壤中筛选出具有重金属抗性的群落中含有Paraburkholderia；而Luteibacter、Effusibacillus、Solibacter、Stenotrophomonas、Tumebacillus和Paucimonas6个菌属与土样重金属含量呈现较强的正相关关系，说明这些菌属具有较好的重金属耐受性，尤其是Stenotrophomonas与Paucimonas被诸多研究证实具有良好的重金属抗性（2018；刘海燕等，2008）。分析认为，若要实现该铅锌矿区土壤污染重金属的原位修复，可富集上述具有 13种具有金属抗性的菌属，作为重金属污染的微生物修复提供菌种，并探索它们对重金属的吸附、转化及钝化能力。

图5 各土样top30菌属相对丰度变化Fig. 5 Relative abundance changes of top30 genera in soil samples

图6 土样top30菌属与重金属含量的冗余分析Fig. 6 redundancy analysis on soil top30 genera and heavy metal concentration

从图6还可明显地发现，top30菌属几乎都集中分布于代表Cd的箭头正方向和反方向上，这也再次说明了Cd污染是该地区土壤面临的最主要的重金属污染。然而在与Cd含量呈负相关关系的菌属中，也存在被证实具有一定重金属抗性的菌属。例如，Sphingomonas被证实能在受重金属污染土壤中存在，对Zn以及Cd具有一定的抗性（Sun et al.，2010；蔡茜茜等，2018；王慧萍等，2010）；Pseudomonas被证明对Pb存在一定的抗性（谭贵娥等，2008）；Streptomyces被证明能够利用多糖和蛋白质对重金属离子进行吸附，也可将重金属离子与热蛋白等物质结合降低重金属的毒性（乔宏萍等，2018）；这些菌属广泛分布在M与L取样点较深的土壤层中，对降低土壤中的重金属毒性和保护作物免受重金属毒害起了重要的作用。

3 结论

本研究对受尾矿砂重金属污染的思的村河谷岸边、柑橘园以及水稻田土壤的不同垂直深度层的土壤进行取样，重点探究了土样中Pb、Zn、Cu和Cd污染情况以及重金属含量与土壤理化性质、物种多样性和纵向微生物优势菌属之间的关系。研究发现：重金属在该地区土壤中存在明显的纵向迁移，重金属污染越严重的土壤中的纵向迁移就越明显；各土样中Cd的潜在生态危害指数均在中等危害水平以上，Cd污染为该地区土壤最主要的重金属污染。各采样点不同深度的MC、pH差别不大，而TC、TN与TS差别较大；通过RDA分析发现，MC以及TS和各类重金属均表现出显著的负相关关系，而TN、TC以及pH与各类重金属之间表现出明显的正相关关系。土壤微生物群落物种丰富度和多样性方面，污染最为严重的河谷岸边的物种丰富度和多样性最低，而受植物根系的影响，柑橘园的20—40 cm深度与水稻田的0—20 cm深度处土壤微生物群落物种丰富度和多样性最高，从而影响其微生物群落的纵向分布。门分类水平上，变形菌门、厚壁菌门与放线菌门在除土样L1外的微生物群落中占绝对优势，三者相对丰度之和超过了70.0%；属分类水平上，各土样的微生物群落菌属组成纵向差异很大，分布极其不均匀。土壤纵向微生物优势菌属Luteibacter、Effusibacillus、Solibacter、Stenotrophomonas、Tumebacillus和Paucimonas6个菌属与土样重金属含量呈现较强的正相关关系，Paraburkholderia、Ramlibacter、Bacillus、Pseudarthrobacter、Pseudoduganella、H16和Nitrososphaera7个菌属与土样重金属含量相关关系近似为0，这些菌属均可能具有一定的重金属耐受能力，可进行富集作为原位修复思的村受铅锌尾矿砂污染的菌剂。