米槠天然林和桔园土壤微生物群落结构的季节性变化

郑裕雄 ，曹际玲 ，杨智杰 *，林成芳 ，黄梦青 ，杨玉盛

1. 福建师范大学/湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地，福建 福州 350007；2. 福建师范大学地理科学学院，福建 福州 350007

微生物是森林土壤中最为活跃的组分，能对土壤性质和环境胁迫的变化迅速作出反应，在土壤碳氮循环过程中起到至关重要的作用（Xiong et al.，2014）。目前，大部分研究表明植被类型能显著改变土壤微生物群落结构和多样性。韩世忠等（2015）利用磷脂脂肪酸（PLFA）研究两种森林植被类型对土壤微生物群落结构的影响，发现土壤微生物群落结构差异主要由植被类型差异引起，天然林土壤磷脂脂肪酸总量和各类群特征脂肪酸含量高于人工林。Potthast et al.（2012）研究发现植被类型变化能显著改变土壤有机质和养分有效性，牧草场土壤真菌和革兰氏阴性菌丰度显著高于天然林。Wang et al.（2017）在海南岛研究发现植被类型变化能显著改变微生物群落组成及其功能，其中橡树人工林细菌和丛枝菌根真菌丰度显著低于热带雨林。此外，土壤微生物群落结构对植被类型变化的响应还受到季节性差异的影响。罗达等（2014）在南亚热带人工林发现土壤微生物群落结构受到林分类型和季节的双重因素影响，其旱季土壤微生物类群和总PLFA显著高于雨季。而 Voríšková et al.（2014）在研究土壤微生物的季节动态时发现，夏季真菌生物量较春季增加了3倍，与植物光合产物的地下分配趋势一致。亚热带地区气象变化复杂，森林凋落物、土壤温度和水分等因素的季节变化影响，导致不同季节间土壤微生物群落结构差异更加显著（郑裕雄等，2018），但果园受到除草翻耕、灌溉和施肥等人工管理措施的影响，土壤微生物群落结构对季节变化产生如何响应以及是否明显仍不清楚。

长期以来，为取得经济发展，满足人们的需求，大面积常绿阔叶天然林经皆伐、炼山和整地后改造为桔园等果园，已使亚热带山区的植被类型发生了巨大的变化（杨智杰等，2010）。福建省现有果园面积5.42×105hm2，占全国果园面积的4.17%，相比森林生态系统，果园生态系统受到人为干扰的强度和频度更为强烈，其对生态系统碳平衡起着重要作用（王超等，2012）。本研究以位于福建建瓯万木林自然保护区内保存较为完整的天然林为对照，选取临近由天然林转变而来的桔园为研究对象，采用PLFA分析技术探讨亚热带山区土壤微生物群落结构对不同植被类型响应的季节动态特征，分析植被类型变化对土壤微生物环境响应力的影响，为维护土壤生态功能稳定和促进山区资源的可持续利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样地概况

研究区设在福建省建瓯市万木林自然保护区（27°03′N，118°09′E），地处武夷山脉东南坡，属中亚热带湿润季风气候，年均气温 19.4 ℃，年均降水量1731 mm（主要集中在4—6月），年均蒸发量1466 mm，相对湿度81%。保护区地貌为东南低山丘陵，土壤为发育在花岗岩和片麻岩之上的南方山地黄红壤。

试验地林分基本特征如表1所示。天然林以米槠（Castanopsis carlesii）为主要建群种，乔木层由薄叶山矾（Symplocos anomala）、木荷（Schima superba）、浙江桂（Cinnamomum chekiangense）、丝栗栲（Castanopsis fargesii）及台湾冬青（Ilex formosana）等组成。草本层以狗脊（Woodwardia japonica）和草珊瑚（Sarcandra glabra）为主。桔园是为 1985年天然林皆伐后人工种植形成，定期施肥，年施肥量0.35 t·hm-2，以复合型化肥NPK为主，旱季灌溉，每年除草翻耕 2—3次，病虫害时适当喷洒农药。土壤基本理化性质为：天然林 pH 5.28，容质量（容重）0.74 g·cm-1，土壤有机碳68.26 t·hm-2，水解氮 147 mg·kg-1，有效磷 2.11 mg·kg-1，年凋落物量5.96 t·hm-2；桔园pH 4.53，容质量（容重）1.14 g·cm-1，土壤有机碳 42.87 t·hm-2，水解氮119 mg·kg-1，有效磷 10.20 mg·kg-1，年凋落物量 2.65 t·hm-2（杨玉盛等，2007；黄梦清，2013）。

1.2 样品采集

在米槠天然林和桔园各随机设置立地条件基本相似的3个20 m×20 m标准样地，各相邻两个标准地之间的缓冲区相隔至少10 m。采用S形5点取样法，分别于 2012年的春季、夏季、秋季和冬季（2013年1月）采集4次土样，先将土壤表层枯枝凋落物去除，再用土钻采集表层0—10 cm土壤，将每块标准地的土样混匀成1个土样，用冰袋保存将其运回实验室。于24 h内挑去根系、凋落物和碎石等，于-80 ℃冰箱保存，待土壤磷脂脂肪酸测定。

1.3 微生物群落结构

磷脂脂肪酸（PLFA）根据 Frostegård et al.（1993）方法命名，PLFA及微生物类型见表2。

采用温和碱性甲酯化方法（Schutter et al.，2000）进行PLFA提取，简单操作步骤：称取10 g冷冻干燥后的鲜土，放于50 mL离心管中，加入23 mL提取液（6 mL氯仿，12 mL甲醇，5 mL磷酸缓冲液），涡旋振荡20 s，超声10 min，重复3次，离心（20 ℃，2500 r·min-1，10 min）后转移上层清液到另一个干净的50 mL离心管，剩余土壤重复上述步骤进行二次提取，将两次提取液合并后充分混匀，在黑箱静置一夜（8 h）。收集下层氯仿相，用 N2吹干，通过硅胶柱分离出磷脂。最后进行甲基化，加入1 mL甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）洗吹干样，涡旋 30 s，再加入 1 mL KOH溶液（0.2 mol·L-1），80 r·min-1低速振荡 5 min 后，在 37 ℃水浴锅中水浴10 min，再依次加入3 mL冰醋酸溶液（1 mol·L-1）、10 mL 正己烷，充分摇匀离心（4 ℃，2000 r·min-1，15 min）后，转移上清液（正己烷相）到干净试管，再向剩余溶液中加入10 mL正己烷重新浸提，转移上层清液到试管，将两次溶解有脂肪酸的己烷溶液合并后充分混匀，氮吹干。用 1 mL甲基叔丁基醚-正己烷溶液（1:1，V/V）洗至样品瓶中，-20 ℃冰箱保存。上机前，用19:0甲酯作为内标溶液，用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）（7890A-5973C，Agilent，USA）进行PLFA的测定。

表1 试验地林分基本特征Table 1 Stand characteristics of study plantations

表2 土壤微生物种群磷脂脂肪酸标记物及其特征比值Table 2 The markers and characteristic ratio of PLFA in soil

1.4 数据处理

采用香农-威纳（Shannon-Wiener）丰富度指数和辛普森（Simpson）优势度指数来表征土壤微生物多样性（徐赢华等，2010）。

Shannon指数：

Simpson指数：

式中，ni是第i种个体数；N是所在群落所有物种个体数之和。

参照Luo et al.（2006）的方法计算响应率，以天然林微生物类群PLFA为对照，研究植被类型变化导致土壤微生物类群分异的特定 PLFA。当响应率数值大于0，表征微生物类群特定PLFA对植被类型变化呈正响应；小于0，则呈负响应。

数据运用Excel 2010和SPSS 19.0进行统计分析。采用双因素方差分析法（Two-way，ANOVA）分析植被类型、季节及其交互作用对各指标的影响，采用 Tukey多重比较法进行差异显著性检验（P＜0.05），绘图由Origin 9.0完成。运用Canoco 5.0对土壤微生物群落结构的变化进行主成分分析（PCA）。数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 植被类型对不同季节土壤微生物 PLFA含量变化的影响

从图1可知，天然林和桔园土壤微生物主要以细菌为优势类群，分别占微生物总 PLFA含量的41.04%和48.01%。天然林微生物类群PLFA含量全年均显著高于桔园，其中桔园夏季微生物类群PLFA含量下降幅度最大，达到 69.3%。天然林和桔园土壤微生物类群PLFA含量随着季节变化均显著下降，微生物类群最高PLFA含量均出现在春季，而天然林微生物类群最低PLFA含量出现在冬季，桔园夏季PLFA含量最低。

图1 两种植被类型土壤微生物PLFA含量的季节变化Fig. 1 Seasonal variation of PLFA content of soil microorganisms in two vegetation types

2.2 植被类型对不同季节土壤微生物特征比值的影响

从图 2可知，天然林春季 F:B比桔园显著低18.74%，而夏、秋和冬季比桔园分别显著高61.45%、52.04%和57.99%。天然林春季G+:G-比桔园显著高出19.40%，夏季比桔园显著低42.01%，而秋冬季节无显著差异。天然林全年 Cy:Pre均显著高于桔园，平均高出66.31%。天然林春夏季节Iso:Ant比桔园分别显著低8.96%和13.36%，而秋冬季节无显著差异。天然林和桔园Cy:Pre和Iso:Ant随季节变化均表现为先上升后下降，在夏季出现最大值。

2.3 植被类型对不同季节土壤微生物群落多样性的影响

从表3可知，天然林夏季土壤微生物群落丰富度指数比桔园显著低1.63%，而优势度指数比桔园显著高30.75%，这表明天然林夏季土壤微生物群落多样性显著低于桔园。天然林春季土壤微生物群路丰富度指数比桔园显著高1.16%，而优势度指数比桔园显著低3.82%，这表明天然林夏季土壤微生物群落多样性显著高于桔园。天然林和桔园土壤微生物群落丰富度指数最低值均出现在夏季，冬季优势度指数均最高，这表明两种植被冬季土壤微生物群落多样性最高，而夏季多样性最低。

表3 植被类型变化对不同季节土壤微生物群落多样性的影响Table 3 Effects of vegetation types change on soil microbial community diversity in different seasons

2.4 植被类型对不同季节土壤微生物群落结构的影响

图2 两种植被类型土壤微生物PLFA特征比值的季节变化Fig. 2 Seasonal variation of PLFA characteristic ratio of soil microorganisms in two vegetation types

图3 植被类型和季节对土壤微生物群落结构影响主成分分析Fig. 3 Principal component analysis (PCA) of the effects of vegetation type on soil microbial community structure relative to season

利用主成分分析法进一步分析植被类型和季节变化对土壤微生物群落结构的影响。从图3可知，主成分 1（PC1）对类群 PLFA 变异的解释率达56.70%，主成分2（PC2）的解释度达到21.86%，共同解释变异的78.56%。天然林与桔园不同季节土壤微生物群落结构发生显著分异。

对影响天然林和桔园季节土壤微生物群落结构的主成分进行得分值计算（表4），在主成分1和主成分2中，植被类型和季节双因素主成分得分值均具有明显差异性，表明季节和植被类型双因素变化对微生物群落结构产生显著影响。

表4 土壤微生物群落结构主成分得分值的差异显著性分析（F值）Table 4 Significance analysis of the difference between principal components of the soil microbial community in score value (F value)

从表5可知，除季节未对F:B产生显著影响，季节变化和植被类型双因素均对土壤微生物群落结构产生显著的影响，这表明土壤微生物群路对植被类型变化的响应随着季节变化会发生显著变异。

2.5 植被类型对不同季节土壤微生物群落特定PLFA的影响

以天然林特定PLFA为对照，利用响应率曲线进一步分析造成桔园和天然林土壤微生物群落差异的特定PLFA。从图4可知，桔园不同季节的土壤微生物群落特定PLFA含量基本均显著低于天然林，不同 PLFA含量的差异幅度不同。除 16:1w7t、Cy:17:00和Cy:19:00外，桔园春季其余细菌PLFA标记物丰度显著下降导致细菌丰度下降的幅度高于天然林，而真菌 18:1w9t标记物丰度显著增加导致真菌丰度下降的幅度低于天然林。桔园春季G+标记物丰度显著下降导致 G+丰度下降的幅度高于天然林，而G-细菌Cy:17:00、16:1w7t和18:1w7t标记物丰度增加导致G-丰度下降的幅度低于天然林。

表5 季节和植被类型变化及其相互作用对土壤微生物群落结构影响的显著性分析Table 5 Significance analysis of the effects of vegetation types change，season and their interactions on soil microbial community structure

图4 植被类型变化对土壤微生物特定PLFA季节动态的影响（95%的置信区间）Fig. 4 Effects of vegetation types change on seasonal dynamics of soil microbial specific PLFA at a 95% confidence interval

3 讨论

土地覆被的变化是土壤微生物变化的驱动力，通过改变凋落物、根系分泌物及有机碳等影响土壤养分贮存和底物有效性。本研究发现，相比天然林，桔园土壤微生物类群PLFA含量显著降低，这可能与桔园管理措施改变土壤地下碳分配，进而影响土壤底物有效性有关。前期研究（Yang et al.，2003；郭剑芬等，2006）也发现，果园年凋落物量比天然林下降5.83%，细根生物量也显著降低。陈香碧等（2012）研究发现，与原生林地相比，受人为干扰的生态系统土壤细菌丰度显著下降。随着桔园长期施肥，土壤pH降低，土壤酸化抑制了土壤微生物生长和活性，降低类群PLFA含量。张逸飞等（2015）研究发现，种植单一树种和农业管理措施造成土壤有机质和养分含量下降，导致土壤酸化，对土壤微生物群落造成负面影响。此外，桔园土壤长期种植单一作物，受除草翻耕和施肥等人为管理措施影响较大，导致地上植被覆盖率低，根系分泌物多样性较低，进而定向选择出能很好适应其环境的土壤微生物，导致土壤微生物群落多样性下降。邓娇娇等（2018）研究发现，人工林和农业用地土壤养分急剧下降，总碳源的利用能力降低，从而造成微生物群落多样性降低。本研究中，夏季桔园微生物多样性显著高于天然林，这可能是与地表植被增加有关。杜毅飞等（2015）研究生草果园时发现地上植被增加能为果园土壤输入大量凋落物及其根系分泌物，改变土壤理化性质，提高了土壤微生物对碳源的利用能力。

本研究发现，季节和植被类型变化能显著改变土壤微生物群落结构（图3）。天然林和桔园土壤微生物类群最高PLFA含量均出现在春季，天然林微生物类群最低PLFA含量出现在冬季，桔园夏季含量最低。李南洁等（2017）在缙云山柑橘林研究时发现季节更替对土壤微生物有显著影响，类群PLFA含量均表现出春季最高，夏冬季节含量最低，这可能受到土壤温度和水分变化影响造成的。不同季节微生物类群特定PLFA含量下降幅度不同，会导致微生物对环境变化的响应能力以及生态系统稳定性变化的响应程度不同。桔园夏、秋和冬季F:B显著低于天然林，这与叶晶等（2016）研究发现耕地F:B比值和土壤稳定性显著低于黄山松林地的结果相同。但本研究中春季桔园F:B显著高于天然林（图 2），表明春季桔园土壤微生物群落结构稳定性高于天然林。这主要因为春季换叶期凋落物量降低，减弱地表林冠层和凋落物淋溶作用；同时，处于生长季的桔树将大量光合作用产物用于增加细根生物量，从土壤吸收大量养分供植物生长换叶，导致根系向土壤输送的易分解有机碳大量减少。土壤中富营养型的细菌因可利用的易分解有机碳含量大量减少而降低，贫营养型的真菌分解利用土壤中低营养和难分解的木质素等高碳氮比有机质维持自身代谢（Blagodatskaya et al.，2007；Ingwersen et al.，2008），生态系统稳定性增加。春季桔园G+:G-比值显著高于天然林，表明春季降低桔园土壤营养胁迫压力。春季细根周转迅速，G-易于利用根系凋落物进行代谢（Moore-Kucera et al.，2008），而夏季 G-标记物丰度下降幅度大于G+，这可能与土壤温度有关。桔树低矮且林冠郁闭度较天然林低，夏季温度高，土壤水分蒸发快，阳光可直射透过林冠和地表稀少的草本层加快土壤温度的上升，也会限制G-生长。杨林等（2016）在高山森林模拟增温对土壤微生物群落结构影响的研究，发现温度升高显著降低土壤有机层G-标记物含量，引起G+:G-升高。

此外，土壤微生物群落可通过改变某些特殊脂肪酸含量来响应植被变化导致的环境胁迫。Cy:Pre反映土壤微生物所处的养分压力状态，其值越高表示微生物对养分竞争越厉害。本研究发现，天然林和桔园微生物最大Cy:Pre均出现在夏季，表明夏季土壤微生物类群对养分竞争激烈。Moore-Kuceraet al.（2008）研究不同林龄黄杉土壤微生物群落结构季节动态时发现，夏季微生物Cy:Pre增加，这主要受到水分压力变化造成的胁迫影响。桔园全年Cy:Pre显著低于天然林（图2），主要是Cy19:00标记物丰度下降造成（图4），这可能是桔园土壤中易被利用分解的有机碳含量降低，导致微生物类群对养分的竞争减弱。杨东伟等（2018）在中国浙江研究时发现，相较于水田，桔园耕层土壤微生物的养分胁迫和所处压力增强，微生物数量降低，这主要与天然林转变为桔园后土壤养分含量不均衡有关。Iso:Ant反映微生物对环境胁迫的适应力，其值越高表示土壤微生物对环境胁迫的适应力越强。天然林春夏季节 Iso:Ant显著低于桔园，表明天然林微生物对养分需求的竞争对其抵抗环境变化的能力产生负面影响。

4 结论

植被类型对土壤微生物群落结构和多样性产生较大影响。天然林土壤微生物类群PLFA含量全年显著高于桔园，但不同季节土壤微生物变化类群不同，变化程度也不同，即植被类型变化对土壤微生物类群的影响表现出一定的季节差异性。此外，植被类型显著改变土壤微生物群落 F:B和春夏季G+:G-，并使不同结构的环丙烷脂肪酸或异构脂肪酸等特殊脂肪酸比值发生改变，表明季节变化在一定程度上改变土壤微生物群落对环境变化的抵抗能力。