利用细胞破碎法提取螺旋藻中叶绿素的提取液研究

杨军，曹菊秀，杨文华，王艳菊

利用细胞破碎法提取螺旋藻中叶绿素的提取液研究

杨军，曹菊秀，杨文华，王艳菊

（云南省丽江市质量技术监督综合检测中心，云南 丽江 674100）

在螺旋藻叶绿素检测中目前采用《进出口螺旋藻中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法》（SN/T 1113—2002），该方法样品前处理需要反复研磨、萃取、洗涤等10多个步骤，客观存在耗时长、对检验人员在各个环节的把控能力要求较高、单次检测时容易产生较大误差、多次复测时重现性差等问题。而采用超声破壁、离心分离的方法，不仅简化了实验步骤，且结果的复现性稳定。重点研究了在对螺旋藻中的叶绿素进行提取时所使用的提取液。

细胞破碎；叶绿素；提取液；丙酮

叶绿素是高等植物和其他所有能进行光合作用的生物体含有的一类绿色色素，属于脂溶性色素，存在于一切绿色植物中，可溶于乙醚、丙酮、乙醇等有机溶剂，不溶于水。因此，可用极性溶剂如乙醚、丙酮、乙醇等进行叶绿素提取。

1 拟定提取液组合

为了寻找到最佳的叶绿素提取液组合，本试验依据实施方案对多种有机溶剂进行了组合，具体情况如表1所示。

表1 提取液及其组合比例

序号试剂组合组合比例（体积比） 1无水乙醇1 2无水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）1∶1 3无水乙醇-乙醚2∶1 4无水乙醇-乙醚1∶2 5丙酮1 6丙酮-乙醇1∶2 7丙酮-乙醚1∶1 8丙酮-无水乙醇-乙醚1∶1∶1 9丙酮-乙醇1∶1 10丙酮-水85∶15 11质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 12质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇3∶1 13质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇2∶1 14质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇1∶2 15质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇1∶1 16质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇1∶3 17质量分数为85%的丙酮水溶液-乙醇1∶4 18丙酮-乙醇-水4.5∶4.5∶1

2 提取液的筛选

在提取液的筛选试验中，本试验将筛选过程分为以下3个阶段：①初选阶段。从18组中选出分层较好的7组。

②复选阶段。从7组中选择提取效果最佳的1组。③确定阶段。通过重复试验验证提取液的有效性。

3 筛选试验

3.1 初选

操作步骤：本试验将《进出口螺旋藻中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法》（SN/T 1113—2002）中质量分数为85%丙酮水溶液替换成表1中的18种提取液组合进行试验。挑选出了7组分层效果好的提取液，如表2所示。

表2 初选提取液一览表

序号提取液分层效果初选结果 1无水乙醇-乙醚（V/V=1∶1）很好保留 2质量分数为85%的丙酮水溶液-无水乙醇（V/V=1∶1）较好保留 3质量分数为85%的丙酮水溶液-无水乙醇（V/V=3∶1）较好保留 4质量分数为85%的丙酮水溶液-无水乙醇（V/V=2∶1）较好保留 5质量分数为85%的丙酮水溶液-无水乙醇（V/V=1∶2）较好保留 6质量分数为85%的丙酮水溶液-无水乙醇（V/V=1∶1）较好保留 7丙酮-乙醇-水（V/V/V=4.5∶4.5∶1）较好保留

3.2 复选试验

本试验针对初选的7组提取液进行了结果分析，研究其提取效果。操作步骤：称取样品0.1 g（精确至0.000 1 g）至15 mL具塞塑料离心管中；加入10 mL提取液，第一次超声提取30 min，3 000 r/min离心5 min，提取液转入125 mL分液漏斗（部分盛有20 mL的水，部分不加水）中；向15 mL离心管中加入10 mL提取液，振摇混合，第二次超声提取15 min，3 000 r/min离心5 min，提取液并入125 mL分液漏斗中；向分液漏斗中加入20 mL乙醚，之前未加水的加入20 mL水，轻摇，静置分层，弃去水层；用水洗涤2次，每次20 mL，轻摇，静置分层，弃去水层；将乙醚层通过一装

有5 g无水硫酸钠的小漏斗，滤入50 mL棕色容量瓶中，用少量乙醚洗涤分液漏斗，并洗去无水硫酸钠层中的色素，定容，摇匀，待测；将上述待测液立即于分光光度计上测定642 nm及660 nm处的吸光值，1 cm比色皿，乙醚作空白；运用《进出口螺旋藻中藻蓝蛋白、叶绿素含量的测定方法》（SN/T 1113—2002）中的计算方法计算。

本试验采用上述方法共进行了4次复选试验，结果如下所示。

3.2.1 第一次提取液复选试验

第一次提取液复选试验结果如表3所示。

表3 第一次提取液复选结果一览表

方法条件：温度为45 ℃；时间方面，第一次为30 min，第二次为15 min 序号提取液称样量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1)0.101 30.2041.25512.366610.4 2质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2)0.101 70.4721.50918.674918.1 3质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1)0.104 90.4481.98921.6941 034.0 4质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1)0.104 40.181.08110.721513.5 5质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1)0.102 90.2151.29312.815622.7 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1)0.101 30.4131.98721.0831 040.6 0.104 40.4082.04821.4391 026.8 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1)0.102 60.3001.70417.169836.7 0.102 00.3681.96220.152987.8

分析：采用乙醇-乙醚（/= 1∶1）、丙酮-乙醇-乙醚（//=1∶1∶1）、质量分数为85%的丙酮-乙醇（/=1∶1）、质量分数为85%的丙酮-乙醇（/=1∶2），这四组提取效果较好。从分层的速度来看，乙醇-乙醚（/=1∶1）分层最快。

3.2.2 第二次提取液复选试验

通过第一次试验发现，将提取液转移至125 mL分液漏斗中，分层效果会受到加水量的影响。因此在本次试验中加入2个第一次加水量为40 mL的试验组作为对比。第一次超声时间为30 min，第二次超声时间为10 min，其余条件与第一次提取液复选试验相同。试验结果如表4所示。

分析：通过第二次提取液复选试验，1号、3号、6号提取液提取效果较好。从分层的难易程度分析，6号分层最快，检测结果相对于其余组别仍然较高，7号检测结果重复性差。

3.2.3 第三次提取液复选试验

通过第二次复选试验，发现2号、3号、4号、5号、7号的第一次加水顺序对分层效果影响较大。本次试验1号和6号先向空分液漏斗中加入20 mL水，转移提取液后加入20 mL乙醚；其余5个试验组先向空分液漏斗中转移提取液，再顺次加入20 mL乙醚和20 mL水进行试验。试验结果如表5所示。

分析：1号分层效果不佳，所以未进行结果的测定；1号在前两次试验中能分层但耗时长，本试验计划在下次试验中改变加水顺序继续研究；2号检测数值最大（1 120.1 mg/100 g）。

表4 第二次提取液复选结果一览表

方法条件：温度为45 ℃；时间方面，第一次为30 min、第二次为10 min；第一次加水：空分液漏斗中先加水，1～6号、8号为20 mL，7号、9号为40 mL 序号提取液称样量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.102 70.3151.98619.435946.2 2质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V= 1∶2）0.105 40.2761.62816.231770.0 3质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.102 30.3341.98719.759965.7 4质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.102 30.2571.55415.388752.1 5质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.1090.6426.402316.6 6乙醇-乙醚（V/V= 1∶1）0.101 10.3432.08220.5861 018.1 0.101 50.3422.07920.5481 012.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.102 30.1821.13411.135544.2 0.102 70.0240.1381.38867.6

表5 第三次提取液复选结果一览表

方法条件：温度为45 ℃，时间方面，第一次为30 min、第二次为10 min；加水顺序：2号、3号、4号、5号、7号试验组先加入20 mL乙醚后再加入20 mL水；1号、6号先加20 mL水再加入20 mL乙醚 序号提取液称样量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.100 9//// 2质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4112.20922.6271 121.3 3质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3512.13521.1011 044.6 4质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.3642.24122.0741 090.6 5质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.100 90.3602.1921.6411 072.4 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.100 50.3232.01619.780984.1 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 30.3492.12220.9691 035.0

3.2.4 第四次提取液复选试验

本次试验6号先加入20 mL水，其余6组顺次加入20 mL乙醚和20 mL水，检测结果如表6所示。

分析：1号改变加水顺序，检测结果超过1 000 mg/100 g，再次证明第一次加水的顺序对螺旋藻中叶绿素的分层效果影响很大。

表6 第四次提取液复选结果一览表

方法条件：温度为45 ℃，时间方面，第一次为30 min、第二次为10 min。第一次加水：1～5号及7号试验组先加入20 mL乙醚再加20 mL水，6号先加入20 mL水再加入20 mL乙醚 序号提取液称样量/gABS/nmX5/（mg/L）X6/（mg/100 g） 642.00 660.00 1丙酮-乙醇-水 （V/V/V=4.5∶4.5∶1）0.101 00.3812.23922.3501 106.4 2质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶2）0.101 00.4642.28624.0791 192.0 3质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=1∶1）0.101 20.3662.21821.9391 083.9 4质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=2∶1）0.101 20.1691.02910.162502.1 5质量分数为85%的丙酮-乙醇（V/V=3∶1）0.101 10.3592.18821.6071 068.6 6乙醇-乙醚（V/V=1∶1）0.101 20.3422.10920.7701 026.2 7丙酮-乙醇-乙醚（V/V/V=1∶1∶1）0.101 20.3221.98319.531965.0

3.3 试验结果

通过复选试验发现，当提取液为质量分数为85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）时，检测值最大且稳定性最好，所以质量分数为85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液最有优势。同时，研究了第一次加水的用量和顺序对分层效果的影响。

4 小结

通过本次试验研究得出如下结论：①质量分数为85%的丙酮-乙醇（/=1∶2）提取液为超声提取叶绿素的最佳试剂组合，提取效果最佳；②加水顺序直接影响分层效果，提取液转移后先加入20 mL乙醚，再加入20 mL水的分层效果最佳。

［1］罗光宏，许耀照，何琳，等.影响分光光度法测定螺旋藻叶绿素含量的因素分析［J］.食品科学，2014，35（14）：151-154.

［2］付丽丽，金晶，吉美萍，等.螺旋藻叶绿素a提取方法探讨［J］.应用化工，2015，44（12）：2196-2198.

［3］杨军，曹菊秀，王艳菊，等.超声波细胞破碎法对螺旋藻中叶绿素提取研究［J］.中国测试，2018（Suppl 2）：1-2.

Q945

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.17.003

2095－6835（2019）17－0007－03

杨军（1975—），男，云南丽江人，本科，高级工程师，主要从事产品质量管理与研究。

〔编辑：张思楠〕