乌梅提取物对特发性高钙尿大鼠肾结石形成和肾功能的影响及作用机制

杨敏，李家兵，刘贵喜，孙懿，罗成君

肾结石是泌尿系统的常见疾病，按结石成分划分，临床上以草酸钙结石最为常见，不仅会引起肾绞痛、血尿等症状，还会对肾功能产生影响[1-2]。目前，肾结石的发病机制仍未完全阐明，也缺乏有效的预防及药物治疗手段。乌梅由蔷薇科植物梅的干燥成熟果实加工得到，富含柠檬酸、苹果酸、丁二酸等有机酸成分，不仅能够在结石形成过程中与钙离子螯合、降低结石形成的风险，还能通过抗炎、抗氧化等方式发挥组织及细胞保护作用[3-4]。特发性高钙尿大鼠的特征是血清钙正常，但肾小管对钙重吸收存在障碍并造成尿钙增加，进而容易自发形成肾结石，是目前用于研究肾结石理想的动物模型。为了明确乌梅提取物对肾结石形成的预防和治疗价值，本研究以特发性高钙尿大鼠为实验对象，具体分析了乌梅提取物对大鼠肾结石形成及肾功能的影响及机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：特发性高尿钙大鼠24只及健康清洁级SD大鼠12只购自四川省人民医院实验动物研究所[许可证SYXK(川)2019-217]，均为雄性，体质量220～250 g，饲养环境22～26℃、湿度40%～60%，自由摄食饮水。(2)试验试剂：乌梅提取物购自Sigma公司，炎性细胞因子及8-羟基脱氧鸟苷(8-OHDG)的酶联免疫吸附检测试剂盒购自上海酶联公司，丙二醛(MDA)的硫代巴比妥酸检测试剂盒及总抗氧化力(T-AOC)的比色法试剂盒购自南京建成研究所，基因mRNA表达检测试剂盒购自北京天根公司。(3)仪器设备：全自动生化分析仪为美国爱德士公司生产，型号Catalyst Dx。显微镜为Nikon公司生产，型号E200。超声仪为VisualSonics公司生产，型号Vevo。

1.2 实验方法 2018年1—12月于西南医科大学临床医学院中心实验室进行实验。健康清洁级SD大鼠12只作为对照组， 特发性高尿钙大鼠24只按随机数字表法分为模型组12只和干预组12只。模型组大鼠常规饲养，给予生理盐水2 ml灌胃，1次/ d，连续28 d；干预组给予0.15 g/ml 乌梅提取物溶液2 ml灌胃，1次/ d，连续干预28 d。

1.3 观察指标与方法 干预28 d后处死大鼠，留取血液标本10 ml，离心得血清在-80℃保存。大鼠开腹后解剖肾脏，等分为2份，1份用4%多聚甲醛固定后石蜡包埋，蜡块在阴凉处保存；另1份用液氮冷冻后在-80℃冰箱保存。

1.3.1 肾功能测定：取-80℃保存的血清标本，采用全自动生化分析仪测定血肌酐(SCr)及尿素氮(BUN)含量。

1.3.2 草酸钙结晶量评分[3]：取石蜡包埋的肾脏组织，制作石蜡切片后进行HE染色，在显微镜下观察每个高倍视野下草酸钙结晶的数量。视野内无结石、结晶为1分，结石、结晶<3个为2分，结石、结晶3～5个为3分，结石、结晶6～10个为4分，结石、结晶>10个为5分。

1.3.3 炎性因子及氧化应激指标测定：取液氮冷冻的肾脏组织适量，加入磷酸盐缓冲液后对组织进行超声匀浆， 离心取上层澄清液体后采用酶联免疫吸附试剂盒测定白介素-1β(IL-1β)、高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)、趋化因子配体2(CCL-2)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、8-OHDG的含量，采用硫代巴比妥酸法试剂盒测定MDA含量，采用比色法试剂盒测定T-AOC含量。

1.3.4 BMP2通路基因测定[5]：取石蜡包埋的肾脏组织，采用石蜡包埋组织切片总RNA提取试剂盒提取组织总RNA，采用FastKing一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂盒将总RNA反转录为cDNA，采用Talent荧光定量检测试剂盒对cDNA进行荧光定量PCR扩增，所用引物分别为BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的特异性引物，根据扩增后仪器上显示的扩增曲线计算基因的mRNA表达水平。

2 结 果

2.1 3组肾功能指标及草酸钙结晶量评分比较 SCr、BUN含量及肾脏组织草酸钙结晶量评分比较，模型组大鼠高于对照组，而干预组大鼠低于模型组(P均<0.01)，见表1。

2.2 3组肾组织炎性细胞因子比较 肾脏组织IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1含量比较，模型组大鼠明显高于对照组，而干预组低于模型组(P均<0.01)，见表2。

2.3 3组肾组织氧化应激指标比较 模型组大鼠肾脏组织MDA、8-OHDG的含量明显高于对照组，T-AOC含量低于对照组；而干预组大鼠肾脏组织MDA、8-OHDG的含量低于模型组，T-AOC的含量高于模型组 (P均<0.01)，见表3。

2.4 3组肾组织BMP2通路基因表达比较 大鼠肾脏组织BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表达水平比较，模型组明显高于对照组，干预组低于模型组(P均<0.01)，见表4。

3 讨 论

草酸钙结石是最常见的肾结石类型，钙盐过饱和沉积是肾结石形成的重要病理生理基础，特发性高尿钙大鼠肾小管对钙的重吸收存在障碍、尿钙明显增加，容易在肾脏内出现钙盐过饱和并出现结石，因而特发性高尿钙大鼠也是研究肾结石常用的动物模型[6]。本研究以特发性高尿钙大鼠作为模型组，通过观察肾脏组织中草酸钙结晶数量及血清中肾功能指标的变化可知，模型组大鼠肾脏组织中草酸钙结晶量评分及SCr、BUN含量明显高于对照组，提示特发性高尿钙大鼠肾脏内大量草酸钙结晶、结石形成且肾功能发生了一定损害，血液中SCr及BUN含量升高。

表1 3组大鼠血清肾功能指标及肾脏组织中草酸钙结晶量评分比较

表2 3组大鼠肾脏组织炎性细胞因子比较

表3 3组大鼠肾脏组织氧化应激指标比较

表4 3组大鼠肾脏组织BMP2通路基因表达比较

目前临床上肾结石尚缺乏有效的药物治疗或预防手段，主要采用体外震波碎石、经皮肾镜取石等外科手段进行治疗。乌梅提取物通过有机酸的协同作用来螯合钙离子、抑制草酸钙结晶形成、防止钙盐饱和析出、预防结石形成。本研究使用乌梅提取物来对特发性高尿钙大鼠肾结石进行预防和治疗，结果表明，干预组大鼠肾脏组织中草酸钙结晶量评分及SCr、BUN含量明显低于模型组，提示乌梅提取物对特发性高尿钙大鼠的肾结石形成具有抑制作用，同时也能改善因结石沉积所引起的肾功能损害。

草酸钙结晶及结石在肾脏内的聚集会持续刺激肾小球内皮细胞和系膜细胞、肾小管上皮细胞，使细胞内的炎性反应、氧化应激反应发生激活，进而引起肾功能发生损害[7-9]。IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1等炎性细胞因子的大量释放是炎性反应激活的特征，IL-1β、HMGB-1具有促炎活性，能够介导炎性的级联放大，CCL-2、MCP-1具有趋化活性、能够介导炎性细胞在肾结石周围组织的浸润[10-12]。氧自由基的大量生成是氧化应激激活的特征，通过引起局部组织结构的氧化损伤来导致肾功能异常，同时伴有氧化产物MDA、8-OHDG生成增多及抗氧化指标T-AOC的下降[13-14]。本研究对上述炎性反应及氧化应激指标的分析显示：模型组大鼠肾脏组织中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明显高于对照组，T-AOC的含量明显低于对照组；而干预组大鼠肾脏组织中IL-1β、HMGB-1、CCL-2、MCP-1、MDA、8-OHDG的含量明显低于模型组，T-AOC的含量明显高于模型组，提示特发性高尿钙大鼠的肾脏组织中炎性反应及氧化应激反应过度激活，乌梅提取物则能显著抑制炎性反应及氧化应激反应。

肾脏局部草酸钙结石或结晶的持续刺激是引起炎性反应及氧化应激反应激活的重要因素，而BMP2信号通路在组织钙化、矿化中起到重要作用。白栩搏[15]的动物研究证实，BMP2信号通路的过度激活参与了特发性高尿钙大鼠肾结石的形成。本研究对特发性高尿钙大鼠肾脏内BMP2通路基因表达的分析显示：模型组大鼠肾脏组织中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表达水平明显高于对照组。这一结果与白栩搏[15]的研究一致，表明BMP2信号通路的过度激活与特发性高尿钙大鼠肾结石的形成密切相关。MSX2、RUNX2是BMP2下游重要的转录因子，通过靶向启动Osx的表达来参与骨形成、组织钙化的调控。在乌梅提取物干预后观察到，干预组大鼠肾脏组织中BMP2、MSX2、RUNX2、Osx的mRNA表达水平明显低于模型组，提示乌梅提取物对特发性高尿钙大鼠肾脏中BMP2通路的激活具有抑制作用。

综上所述，乌梅提取物对特发性高钙尿大鼠肾结石形成及肾功能均具有改善作用，同时也能抑制肾脏组织中炎性反应、氧化应激反应及BMP2通路的激活，这也可能是乌梅提取物改善肾结石形成及肾功能的相关分子机制。

利益冲突：无

作者贡献声明

杨敏：负责实验设计、整体实施及论文写作；李家兵：负责实验指导及论文审校；刘贵喜：负责动物的干预及取材；孙懿、罗成君：负责指标检测和数据录入