天麻姜制前后对小鼠宏观行为和脑组织形态结构的影响※

李晓芳 叶伟 梁文琴 张霞 范晖 李清 叶慧 陈婷 叶喜德*

（1 江西中医药大学附属医院药剂科，江西 南昌 330006；2 江西景德镇中医院药剂科，江西 景德镇 333000；3 江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004）

天麻（Gastrodia elata Blume），又名赤剑、明天麻、定风草等，是一种名贵中药，以春、冬两季采挖，春季采挖者名春麻，冬季采挖者名冬麻，但冬麻质量较好。天麻经采集过后，除去须根，洗净，再依法进行炮制。现代天麻炮制方法主要是润制和蒸制切薄片法，姜天麻制法早在清代《幼幼集成》中就有记载［1］，但该法局限于常规炙法，研究也只限于形状鉴别，未进行深入研究。本文中的姜天麻，是基于江西“建昌帮”特色炮制法，该药帮为我国南方古药帮和中药炮制重要流派之一，常以“樟帮”合称为“江西药帮”［2］。采用姜汁炮制天麻，目的是增强天麻止痛、抗眩晕之效。前期研究基础表明，天麻经姜制后，其主要成分天麻素发生了变化［3］。因此，本研究拟从动物宏观行为学结合脑组织形态，通过比较天麻姜制前后不同炮制品之间的差异，考察姜制对天麻的影响，从而为深入开展姜天麻药效试验奠定基础。

1 实验材料

1.1 动物 昆明种小鼠SPF级40只，体重18～22 g，雄性，济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2014-0007。

1.2 药材与试剂5-HT（PAA808G01，cloud-clone Corp.）；聚合HRP标记抗兔IgG（SV0002，博士德）；5%BSA封闭液（SW3015，Solarbio）；DAB显色试剂盒（CW0125，CWBIO）；中性树脂（CW0136，CWBIO）；苏木素染色（AR1180-1，博生德生物）鲜榨生姜汁 生天麻药液 姜制天麻药液、0.9%的生理盐水、4%多聚甲醛、4%戊巴比妥钠（上海榕柏生物技术有限公司）。天麻、生姜购于江西省樟树中药材市场，经江西中医药大学教授龚千锋鉴定为天麻药材。

1.3 仪器 电热鼓风干燥箱（DHG-9070A）；热恒温培养箱（DHP-9054，山东博科生物科技有限公司）；显微镜（CX41，OLYMPUS）；切片机（BQ-318D，伯纳）；移液枪（Research plus 0.5～10μL，eppendorf）；移液枪（Research plus 20～200μL，eppendorf）；高压锅（YS20ED，苏泊尔）等鼠笼6个 型号：M1规格290×178×160 mm六个刻度饮水瓶；电子秤CP214奥豪斯仪器上海有限公司产品；垫料；电煎药砂锅（金成白瓷砂锅潮州市潮安区彩塘镇煌达五金厂JC-35B）；101-1A电热恒温鼓风干燥箱上海沪粤命科学仪器有限公司；828L福意联恒温冰箱（2～20℃，青海海尔股份有限公司）；蒸制容器（电饭锅廉市博鸿电器厂CFXB30）；电子天平cp214奥豪斯仪器（上海衡平仪器仪表厂产品）；眼科剪、镊子、棉球等常规实验器材。

2 实验方法

2.1 炮制品制备 生天麻：取天麻原药材200 g，除去残茎杂质并用清水清洗干净，均匀摊开平放于蒸架上，再将蒸架放在盛有适量水的蒸制容器内，隔水蒸制，利用水蒸气将天麻蒸至彻底软透无白心，随即将其取出，趁热切成薄片，然后将薄片均匀摊开放至于托盘上，将托盘放入40℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干，取出备用。

姜天麻：取制备出的生天麻100 g，另取姜汁12.5 mL，基于江西“建昌帮”炮制方法，将生姜汁倒在已制备好放在烧杯中的生天麻，加少量的蒸馏水使姜汁的液面高于生天麻，烧杯口套上保鲜膜，浸泡过夜。待生姜汁被吸干后，将其取出，均匀摊开摆放于托盘中放入20℃烘箱中烘干即可，待用。

2.2 药液制备 生天麻药液：称取已经制备好的生天麻20 g，放入已经清洗干净的电饭煲中，加入适量水浸没生天麻，放置浸泡30 min后开始煎煮，煎煮20～25 min后倒出煎煮液，再加入适量水进行第2次煎煮。将2次煎煮液合并即得生天麻药液。

姜天麻药液：称取已经制备好的姜天麻20 g，放入已清洗干净的电饭煲中，加入适量水浸没姜天麻，浸泡30 min后开始煎煮，煎煮20～25 min后倒出煎煮液，再加入适量水进行第2次煎煮。将2次煎煮液合并即得姜天麻药液。

鲜生姜汁：称已洗净的鲜生姜5 g，用纱布包着放入研钵中用钵杵完全捣碎，尽可能倒出全部姜汁，按照姜汁与水的比例1∶4加水稀释，生姜汁都是现榨现用，保证其新鲜度不受到影响。

2.3 动物分组与给药 昆明种SPF级雄性小鼠40只，体质量（20±2）g，随机分为4组，每组10只，分别为空白组、生天麻组、姜制天麻组、生姜组，给药组按0.1 mL/g的剂量灌胃给药，空白组给予等量生理盐水，用苦味酸对每个笼中的小鼠进行标记。各组小鼠于同一环境条件下，室内为22～26℃，保持周边安静，自由进食和饮水，适应性饲养3 d。

药液预处理将制备好的药液和生理盐水，从冰箱中取出后，放至常温。姜汁为临时压榨，按1∶4的比例加水稀释，备用。

给药：将饲养后的小鼠，按照0.1 g/mL浓度灌胃给药，灌胃结束后将小鼠放回换好干净的垫料笼子中，每组投放100 mL水，并做好饮水记录。食物投放量为100 g，每天查看，并做好记录食物和水的消耗量，每隔5 d，分别对各组小鼠称重，以便观察其体重变化。连续灌胃30 d。记录实验过程中小鼠体重、饮水量、饮食量、毛发以及大便色质的变化。

2.4 脑组织样品制备 方法：实验结束后，依照如下方法进行解剖：（1）小鼠称重，每组小鼠腹腔注射4%戊巴比妥钠（0.0025 mL/g）进行麻醉；（2）将麻醉小鼠置于手术台上，剪掉毛发，解剖小鼠，镊子提起心脏尖端，注射器刺破心尖部进针约0.5 cm，并切开右耳；（3）用生理盐水进行灌注，直至右侧耳廓流出的液体为无色，同时小鼠肝脏苍白，停止灌注；（4）采用4%多聚甲醛进行灌流至小鼠肢体突然紧张，尾部卷曲，即可；（5）用剪刀剪开颅骨，取下小鼠完整大脑；（6）将大脑放入准备好的多聚甲醛中固定2～4 h，然后移到30%蔗糖中放在4℃的冰箱中过夜。

2.5 免疫组化及染色 主要步骤：（1）烤片：组织切片入放入65℃烤箱中烤2 h；（2）脱蜡：切片在二甲苯放置10 min；（3）水化：将切片依次放入95%、80%的乙醇和纯化中水各3 min；（4）抗原修复：将切片加入抗原修复液（柠檬酸缓冲液），高压锅加热到自动放气，自然冷却，弃去抗原修复液，用PBS淋洗，加入新鲜配制的3%双氧水，室温孵育10 min，PBS充分淋洗；（5）非特异性封闭：PBS浸洗玻片3次，吸干组织周围的PBS，滴加5%BSA，37℃封闭30 min；（6）免疫反应：用吸水纸吸掉组织周围的封闭液，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗5-HT（10μg/mL），放入湿盒中，4℃孵育过夜；（7）显色复染。

3 结果

3.1 天麻姜制前后对小鼠宏观行为学的影响 各组实验饲养环境相同，以便排除外在因素对实验结果的影响。各组试验小鼠在毛发、粪便和活动量等方面差异明显。在便质方面，与空白组相比，姜制天麻和生姜组小鼠的粪便较为干燥，天麻组小鼠粪便较顺滑、潮湿；在活动量方面，与空白组相比，生天麻组的小鼠较安静、无异常兴奋状态，生姜组和姜制天麻组的小鼠呈现好动状态，喂药时较反抗。说明姜制天麻会影响小鼠代谢功能，提示以姜为辅料，来炮制天麻，会对天麻的药性产生一定影响；从观察天数的平均饮水量上看，与空白组相比，姜天麻组和生姜组饮水量明显增加，生天麻组增加并不明显。提示天麻经辛温之生姜炮制后，有可能使药材性能发生改变。饮水量逐渐增加，说明随着温性药材用量加大，可能会对体内的阴液产生影响，从而出现口渴症状。见表1、图1。

表1 天麻姜制前后对小鼠宏观行为学的影响

图1 不同组别饮水量变化情况

3.2 小鼠脑组织显微图 空白组中神经元细胞形态规则，细胞核呈圆形，胞浆丰富、均匀淡染。

与空白组相比，天麻组组和生姜组小胶质细胞，明显变小、增多，排列更趋密集。姜天麻组的神经元和小胶质细胞尤为突出，且神经元结构清晰，细胞核形态规则、染色质均匀分布、细胞器丰富。但随着给药时间的延长，神经元结构发生了变化，形态不规则化，小胶质细胞发生肿胀、部分细胞有凋亡的趋势，见图2～5。

图2 空白组（×400）

图3 天麻组（×400）

图4 姜天麻组（×400）

图5 生姜组（×400）

3 讨论

中药炮制方法是我国历史悠久的制药技术，中药经过加工炮制以后，势必会影响到药物性能，进而影响药效作用，而炮制的主要目的是减毒增效［4］。天麻为平性药材，味甘，入肝经，具有平抑肝阳、熄风止痉之功。为临床常用中药，在用治偏头痛方面，效果显著。现代研究表明［5］，头痛病因较多，既有内因，也有外感受寒致使毛血管收缩、肌肉痉挛等原因引起。而改善微循环，增加血液流变学，是现代研究缓解头痛的主要途径［6］。本研究采用辛温之生姜为辅料，来炮制性平之天麻，其机理就是基于“姜制温散”原理，通过改变药物性能，使其转温；从现代机理角度，通过辅料生姜扩张血管，改善血液流变学，以达到增强天麻镇静止痛作用。

研究通过观察小鼠行为学基本特征和变化，来推测药性变化。结果表明，小鼠在给予天麻不同炮制品时，各组别小鼠的粪便、活动量、毛发和饮水量相应的发生了改变。在于空白组相比，姜制天麻组较天麻组，呈现的热性表征较为明显。毛发较为干枯，小鼠活动量或抗拒食物相应发生变化。天麻组小鼠则相对安静，无异常兴奋性现象发生。在饮水量方面，姜制天麻可能组小鼠稍有增多，说明姜制影响天麻药物性能，这种变化是否与天麻镇静止痛作用相关，还有待进一步阐明。

同时，通过观察受试小鼠脑组织形态结构的变化，进一步弄清姜制天麻炮制前后变化差异。脑组织形态中小胶质细胞，是脑组织中一种免疫细胞，对外界刺激敏感性较大。小胶质细胞作为脑组织损害的“信号弹”［7］，中枢神经系统在受到摄入物影响时，小胶质细胞是系统中最早发生反应的细胞类型，也是一些受体和分泌物的主要储库，通过吞噬作用和分泌作用进而保护神经元细胞［8］。

在脑组织显微图中发现，与空白组相比，姜天麻、生姜和天麻组的小胶质细胞发生了变化，姜天麻组增加较为明显。小胶质细胞增多可以更好地保护神经元；同时小胶质细胞的增多说明脑组织中微环境产生了变化。但随着给药的时间延长，部分细胞神经元结构发生了变化，其形态出现了不规则化，小胶质细胞肿胀，形态发生了变化。根据上面种种表明姜制天麻炮制前后对小鼠脑组织形态结构产生了影响。

可见，考察动物宏观行为学和脑组织形态结构的变化，是考察药物炮制前后药性差异的重要因素，希望本研究可为深入研究天麻奠定基础。