远志提取物改善老年大鼠记忆功能及对海马、皮质氧化自由基代谢的影响

任子顾，许保海

老年人在衰老及诸多基础性疾病的作用下，机体逐渐进入至各项功能自然衰退期。氧化自由基水平异常升高为机体衰老、诸多退行性病变的重要诱因。衰老可引起氧化自由基代谢障碍，对胆碱能系统造成损伤，诱发大脑海马神经元、皮质结构等发生异常改变，造成陈述性记忆功能受损，并可逐渐进展为阿尔茨海默症(alzheimer’s disease，AD)[1-3]。因此，阻断或延缓这一进程对于抗衰老、改善老年人记忆功能及预防AD均具有重要意义。然而，目前临床上对于这一进程尚无特效药物，西药治疗本病疗效欠佳，且因副作用较大，长期应用患者耐受度较低。远志中医常用的益智类药物，其主要成分为远志皂苷、寡糖脂类等活性物，具有改善记忆力、抗氧化、抗衰老、抗炎及保护神经等功效。远志提取物具有改善AD小鼠模型学习记忆功能及减少脑β淀粉样蛋白积聚的功效，但其作用机制尚未能完全明晰[4-6]。目前，临床上关于远志改善AD患者及动物模型记忆、认知功能等的研究较多，但正常衰老相关的研究较少。因此，本研究以老年大鼠为观察资料，客观评估远志提取物对老年大鼠记忆功能的作用，以及其对老年大鼠大脑海马体、皮质氧化自由基代谢的影响。

1材料与方法

1.1 材料 由中国医科大学动物部提供24只24月龄的老年Wistar大鼠，随机分为2组，老年非用药组、老年用药组，每组12只，另选取12只6月龄的青年大鼠为对照组，全部大鼠均为雄性。对照组大鼠体重为150～210g，平均(182.65±5.64)g，老年非用药组大鼠体重为380～490 g，平均(435.17±2.31)g，老年用药组大鼠体重为370～510 g，平均(436.12±2.47)g。老年大鼠体重高于青年大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)，2组老年大鼠体重差异无统计学意义。

远志购自于同仁堂中药饮片公司。提取物制备，按远志体积分数75%量取乙醇进行浸泡，后以超声破碎，过滤残渣后使用茄型瓶旋蒸，获得膏状提取物。使用时以聚乙二醇加蒸馏水充分溶解。

一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)试剂盒及硫代巴比妥酸均购自上海酶联生物科技公司。SPECTRUM、SP-2000UV紫外线可见光光度计购自上海光谱仪器公司。水迷宫实验视频分析系统购自成都泰盟软件公司。

1.2 实验方法

1.2.1 干预方法 老年非用药组与对照组均不予任何干预，正常喂养，自由食水自由活动3个月。老年用药组给予远志提取物溶液200 μl，其中远志提取物含量为200 mg/kg，灌胃，1次/d，维持3个月。

1.2.2 记忆功能 采用Morris水迷宫实验[7]评估。干预3个月后，行 Morris水迷宫实验，在训练泳池水中加入牛奶使水质浑浊，水温控制在22 ℃左右。水池划分为东、南、西、北4个象限，将平台置于某1个象限中央，使池水没过平台约3 cm。第1-5天行定位航行训练，第1天将各组实验动物放入池中游泳120 s适应水池环境；第2天于某1个象限内置入平台，将实验动物按顺序从各象限朝池壁方向放入池水中，开始获得训练，记录大鼠寻找到平台的用时，逃避潜伏期设置为120 s，将120 s内未能寻找平台的大鼠引导至平台停留10 s，1次/d，连续训练5 d，第5天训练结束时为结果数据。定位航行实验结束后24 h，除去平台，开展空间搜索实验，记录全部大鼠120 s内穿越平台位置的次数、在平台象限的停留时间、平台直径2倍范围的有效区内停留时间、游泳总路程。实验全程共计6 d，1次/d。

1.2.3 氧化自由基代谢 以NO、MDA、SOD、CAT水平为氧化自由基代谢评估指标。于全部实验结束后24 h内，处死全部大鼠，断头取脑，使用0 ℃生理盐水进行冲洗，迅速分离海马体与大脑皮质。于0 ℃条件下超声粉碎海马体与大脑皮质组织，制备为100 g/L的组织匀浆；温度4 ℃，3000 r/min，离心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱储存待检。按硫代巴比妥酸法检测上述上清液中NO、MDA、SOD、CAT水平。

1.2.4 组织学检查及细胞计数 断头取脑，用甲醛溶液固定，制作石蜡切片，内氏体染色，光镜下观察海马细胞形态变化。行常规石蜡包埋、切片，H-E染色，细胞计数1 mm2(×50)取双侧海马细胞数的均值。

2 结 果

2.1 水迷宫试验 各组水迷宫试验结果数据差异具有统计学意义(P<0.05)。进一步对比，对照组青年大鼠第5天逃避潜伏期、穿越平台次数、平台象限停留时间、有效区停留时间、游泳路程均优于其他各组，其次为老年用药组，老年用药组优于老年非用药组，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 海马氧化自由基代谢指标 各组大鼠海马体NO、MDA、SOD、CAT水平差异均具有统计学意义(P<0.05)。进一步对比，对照组青年大鼠海马组织NO、MDA、SOD、CAT水平均优于其他各组，其次为老年用药组，老年用药组优于老年非用药组，差异均有统计学意义(P<0.05，表2)。

指标对照组老年非用药组老年用药组FP第5天逃避潜伏期(s)24.05±3.4747.15±4.71①31.11±4.06①②187.6310.000穿越平台次数(次)4.75±0.482.69±0.36①3.45±0.61①②58.3870.000平台象限停留时间(s)40.10±5.2423.16±4.92①34.76±5.00①②36.3940.000有效区停留时间(s)16.99±1.3010.34±0.86①14.85±0.93①②198.2540.000游泳路程(cm)313.57±16.29203.65±14.02①291.54±14.82①②185.4360.000

注：与对照组比较，①P<0.05；与老年非用药组比较，②P<0.05

指标对照组老年非用药组老年用药组FPNO(μmol/g)39.15±5.2994.85±7.02①47.33±6.47①②239.1960.000MDA(μmol/g)16.73±1.7731.64±5.43①20.23±4.22①②43.4780.000SOD(μU/g)114.06±6.0139.15±4.58①91.58±5.13①②625.1870.000CAT(U/mg)5.18±0.752.03±0.79①4.09±0.88①②56.4380.000

注：与对照组比较，①P<0.05；与老年非用药组比较，②P<0.05

2.3 大脑皮质氧化自由基代谢指标 各组大鼠大脑皮质NO、MDA、SOD、CAT水平差异具有统计学意义(P<0.05)；进一步对比，对照组青年大鼠大脑皮质组织NO、MDA、SOD、CAT水平均优于其他各组，其次为老年用药组，老年用药组优于老年非用药组，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

指标对照组老年非用药组老年用药组FPNO(μmol/g)38.03±4.1369.68±7.28①45.53±5.17①②147.1830.000MDA(μmol/g)14.98±1.9428.74±5.37①19.40±4.4①②36.5270.000SOD(μU/g)121.25±7.0242.19±5.27①95.45±4.54①②597.5140.000CAT(U/mg)6.18±0.813.04±0.65①5.18±0.82①②67.5020.000

注：与对照组比较，①P<0.05；与老年非用药组比较，②P<0.05

2.4 各组大鼠海马形态学观察结果及计数比较 对照组大鼠海马锥体细胞层结构紧密，层次丰富。老年非用药组海马锥体细胞排列稀疏，细胞线变得不清晰。老年用药组海马锥体细胞线清晰，明显优于老年非用药组。对照组锥体细胞核大、染色浅、细胞质丰富、细胞排列紧密。老年非用药组形态正常的细胞数明显减少，细胞结构不完整，细胞核固缩，有的形成碎片。细胞质内内氏体减少，细胞排列稀疏、形态异常。老年用药组细胞排列紧密、数量明显增多，内氏体丰富，仅见少数细胞变性。单位面积细胞计数分别为对照组(152.21±17.34)、老年非用药组(72.23±23.38)、老年用药组(138.27±24.97)，3组间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

随着我国社会老龄化结构逐渐加深，全社会对于抗衰老课题亦日渐重视。自由基损伤诱导衰老理论目前已经达成广泛共识。人体内的诸多自由基可随年龄增长而积聚，特别是过度的氧自由基可诱发神经元细胞损伤与凋亡，从而导致记忆功能、认知能力等衰退。人体的大脑与其他重要器官相比，抗氧化的能力相对更为羸弱，对于氧化损伤具有高度敏感性，自由基的过度积累可逐步形成海马神经元的变性，造成认知功能减退。学习、记忆功能为脑部高级功能，学习记忆功能衰退标志着脑功能的全面退化，为脑衰老的一项重要表现。氧化应激反应为脑衰老相关神经功能退行性病变的一项重要诱因。因此，拮抗氧自由基相关损伤已经成为了防治脑衰老相关疾病的新途径。脑组织中的NO、MDA、SOD、CAT含量均为脑细胞中脂质过氧化程度与细胞损伤的重要监测指标。正常健康状态下，机体所产生的氧自由基及其清除系统保持动态平衡，一旦这一平衡机制发生紊乱，作为主要抗氧化酶活性物质SOD的水平下降，氧自由基过度积聚，形成氧化应激性损伤，使体内脂质的过氧化物MDA水平上升，久之诱发细胞膜的损伤，组织器官的功能受损，机体各器官功能进入至衰退期[8-10]。过度氧自由基损伤为老年性痴呆、AD、认知功能障碍等诸多神经退行性病变的一项重要诱因与致病基础[11，12]。因此，清除过度氧自由基为延缓衰老、预防衰老相关脑疾病的一项重要措施。

众所周知，抗衰老为人类一贯致力研究的重要课题，但目前仍尚未发现特效方法，我国中医学在这一领域拥有悠久历史与丰富经验。中医学理论认为，脑衰老是因脑髓失养引发，《医林改错》中指出，年高者记性渐减，因脑髓渐空所致[13]，且患者多因痰湿上扰心神而使神智失节。因此治疗中应选用益智、祛痰类药物。远志为中医学临床上常用的益智类药物，其为多年生草本植物，具有益智安神、祛痰消肿等功效，主要应用于神忡智昏、惊悸健忘、神志恍惚、心肾不交导致的失眠多梦等症的临床治疗中[14，15]。

本研究采用动物模式研究了远志对老年大鼠记忆功能的改善作用，及其对大鼠海马、脑皮质氧化自由基代谢的影响。本研究选用青年大鼠作为对照组，另将老年大鼠分别纳入不进行任何干预的老年非用药组以及以远志干预的老年用药组。通过实验，对照组大鼠水迷宫各项试验结果均优于各老年大鼠组，在老年大鼠中老年用药组优于老年非用药组。由此可知，老年大鼠存在明确的记忆功能衰退，经远志干预后可改善老年大鼠的记忆功能，但3个月的干预期内未能达到健康青年大鼠水平。对各组大鼠脑部海马、皮质组织进行化验对比的结果表明，对照组青年大鼠海马与大脑皮质组织中NO、MDA、SOD、CAT水平均优于老年大鼠，在老年大鼠中老年用药组优于老年非用药组。由此可知，远志能够改善老年大鼠海马、皮质组织中氧化自由基的代谢功能，提高过氧化物清除能力，但仍未能达到健康青年大鼠的清除能力。本研究亦发现，远志提取物能够改善老年用药组的细胞形态，单位面积细胞计数较老年非用药组更佳，但亦不及对照组。延长远志的应用时间是否可进一步扩大上述功能有待于进一步研究。

综上所述，远志提取物能够改善老年大鼠记忆功能，这一改善功效主要与远志有效改善海马区细胞形态，提高了老年大鼠脑海马、皮质组织中氧化自由基代谢功能，增强了脑部过氧化物清除能力的机制相关。