探索miRNA-155对急性髓系白血病患者预后影响及可能机制

沈 瑞，李杰平，展会恩，彭剑娇，徐宏向，曾惠奇

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)是成人最常见的急性白血病。近年来，尽管靶向治疗及干细胞移植等治疗手段极大改善了患者的预后，但是还有近一半的患者不能获得长期生存，其相关机制及治疗靶点仍有待进一步探索[1]。miRNA-155是一种功能广泛的小核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，可参与机体的免疫应答、炎性反应、细胞分化等生物过程，并与肝癌、乳腺癌、淋巴癌等多种癌症的发生与进展密切相关[2]。有学者发现，miRNA-155在AML中亦呈高表达状态[3]，但既往研究多着重于比较外周血中miRNA-155表达水平高低与临床指标的相关性，欠缺长期随访数据，潜在机制也尚未完全阐明。本研究拟借助公开的临床数据库—癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)和生物信息学手段分析miRNA-155表达水平对患者生存率的影响，以及miRNA-155调控AML的潜在分子机制，为AML的预防及治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从包含TCGA数据网站(http://www.linkedomics.org)下载AML数据集TCGA_LAMLmiRNASeq、TCGA_LAMLRNAseq和TCGA_LAML Clinical，筛选出同时包含miRNA-155表达水平测定和完整临床数据的病例共162例，按照miRNA-155表达水平由高到低排序，将排在前50%的81例设为高表达组，剩余81例设为低表达组，应用GraphPad Prism软件绘制两组患者生存曲线。

1.2 方法 利用Omisc软件，将上述患者的各RNA表达水平逐一与miRNA-155表达水平进行Pearson相关性检测，根据相关系数分别选取与miRNA-155正相关和负相关的前50个基因。将筛选出的100个相关基因导入String在线数据库(http://string-db.org/)，进行生物学注释和分类，即完成基因本体(gene ontology, GO)富集分析(分为生物学过程、细胞组分和分子功能三个类型板块)和京都基因与基因组百科全书(the Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway, KEGG)通路富集分析，同时获得相关基因所编码的蛋白质之间的相互作用，从而找出处于网络核心的关键蛋白。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件进行数据处理，生存时间的比较使用Gehan-Breslow-Wilcoxon分析，相关基因筛选采用Pearson相关性分析。P<0. 05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组年龄、性别及种族比较 高表达组与低表达组在年龄[(53.99±17.25)岁vs(53.73±15.25)岁]、性别构成(男性∶女性=42∶39vs37∶44)与种族构成(白人∶黑人∶亚裔=41∶15∶25vs44∶11∶26)方面比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 miRNA-155表达水平差异对生存时间的影响 miRNA-155低表达组患者的中位生存时间长于miRNA-155高表达组，差异有统计学意义(P=0.045，图1)。

图1 miRNA-155对两组急性髓系白血病患者生存率比较

2.3 miRNA-155相关基因筛选结果 在检测的19，448个基因中，有2347个基因与miRNA-155存在相关性(P<0.05)。其中21号染色体开放阅读框71(chromosome 21 open reading frame 71, C21orf71)和芳基烃受体核转位样蛋白2(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like protein 2, ARNTL2)与miRNA-155表达水平的正相关系数最高(分别是r=0.634，P<0.05和r=0.526，P<0.05，图2A、B)；溶质载体家族13成员5(solute carrier family 13 member 5, SLC13A5)和Ski样蛋白(ski-like protein, SKIL)与miRNA-155表达水平的负相关系数最高(分别是r=-0.50，P<0.05和r=-0.48，P<0.05，图2C、D)。

2.4 GO富集分析和KEGG通路富集分析 结果可见主要涉及的生物学过程包括DNA复制启动、DNA链延伸与DNA双链展开，主要涉及的分子功能为解旋酶活性、作用于DNA的催化活性和DNA复制起始的结合，主要涉及的细胞组分为微染色体维持复合体、三级颗粒和富含纤维蛋白-1的颗粒膜，主要涉及的信号通路为DNA复制、细胞周期调控和基础切除修复，见表1。

图2 与miRNA-155相关基因的表达水平

A、B. 和miRNA-155正相关且相关系数最高的2个基因；C、D. 和miRNA-155负相关且相关系数最高的2个基因

表1 完成基因本体富集分析和KEGG通路富集分析

2.5 蛋白相互作用网络 相关基因编码蛋白之间的相互作用网络见图3，其中微小染色体维持蛋白(microchromosome maintenance proteins，MCM)基因家族是处于网络核心的蛋白。

3 讨 论

AML是血液系统常见的恶性肿瘤，近年来随着靶向治疗新药的应用及干细胞移植的开展，极大改善了患者的预后，但治疗复发性和难治性病例时，仍然缺少有效方法，大多数患者最终死于耐药和复发[4]。miRNA是一类内源性非编码RNA，成熟miRNA可与靶mRNA的3′U TR或5′U TR互补结合，并导致mRNA降解或抑制mRNA翻译，从而抑制基因表达[5]。越来越多的研究发现，miRNA的失调对肿瘤的形成和进展起着重要作用。其中miRNA-155在多种肿瘤的形成中扮演重要角色，例如在乳腺癌中，其过表达可使端粒重复序列结合蛋白1的表达受到抑制，导致端粒损伤，并影响细胞分裂[6]；在甲状腺乳头状瘤中，其可通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，促进肿瘤生长[7]。亦有学者发现，miRNA-155与AML患者预后不良有关[8]，但缺少长期随访数据，且相关机制仍未完全阐明，miRNA-155能否作为一种提示AML远期预后的生物标志物仍有待于进一步探讨。

图3 相关基因编码蛋白相互作用网络

TCGA数据库是美国国家癌症研究所和国家人类基因组研究所在2005年发起的一个项目，在过去的十余年里，TCGA收录了加拿大和美国地区11 000多例肿瘤组织以及相匹配的正常组织，和约2.5 PB的高通量基因组测序结果，TCGA创建的基因组数据分析流程，可有效收集、选择和分析组织基因组改变，并结合收录患者的诊断和治疗信息，为改进癌症预防、早期检测和治疗提供了强大的研究基础[9]。本研究通过对TCGA数据库中162例AML患者的随访数据进行分析后发现，miRNA-155过表达会导致远期生存率降低，但具体机制尚不明确。为此本研究基于TCGA数据库中的基因检测结果，筛选出与miRNA-155表达密切相关的基因，并进行富集分析，以求挖掘出潜在机制。结果可见，C21orf71、ARNTL2、SLC13A5和SKIL与miRNA-155表达水平的相关性最为明显。其中C21orf71位于21号染色体，戴海萍[10]的研究发现，在AML患者中可存在11、21号染色体发生相互易位，这可导致其与伙伴基因一起转录新的融合蛋白，干扰造血细胞调控，促使AML病情的进展[11]。ARNTL2又名周期样因子，在细胞的昼夜节律调解中发挥重要作用，昼夜节律调节失常，可导致心血管疾病，癌症，代谢综合征和衰老等一系列疾病的发生[12]。SLC13A5是高亲和力的钠/柠檬酸协同转运蛋白，介导柠檬酸盐进入细胞，可以促进循环柠檬酸盐的利用，以产生能量和合成脂肪酸及胆固醇[13]。SKIL在响应细胞外信号的细胞分裂或分化中具有调节作用，有研究表明SKIL基因突变可引起胰腺肿瘤的形成[14]。这也提示miRNA-155可能通过上述靶基因在AML的进展中发挥作用。

GO富集分析结果与KEGG通路富集分析显示，miRNA-155的相关靶基因所编码的蛋白的功能多集中在细胞周期与DNA复制的全过程。蛋白网络分析可见，MCM蛋白家族处于网络的核心。MCM又称为DNA复制许可因子，MCM蛋白的早期分级可产生多种多聚体复合物，其具有不同的生物学意义，例如MCM467复合物显示具有体外解旋酶活性，其被MCM2亚基抑制。 MCM2-7六聚体在DNA复制起始和延伸中是必不可少的[15]。这也与miRNA-155靶基因的富集分析结果一致。

综上所述，本研究基于miRNA-155从数据库挖掘AML的潜在作用机制，发现 miRNA-155过表达与AML患者远期生存率降低有关，可能与其通过相关靶基因调节DNA的复制有关，这为 miRNA-155的临床价值提供了生物信息学证据支持。