穿心莲内酯对氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠免疫功能的影响

樊成红 张晓延

(山西医科大学汾阳学院检验系，山西 汾阳 032200)

穿心莲别名春莲秋柳、苦胆草，主要生长在我国南方广东、福建各省，味苦性寒，是一种生爵床科草本植物。穿心莲根部可提取出黄酮类化合物，叶部可提取内酯类化合物〔1〕。穿心莲内酯为穿心莲中提取的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一〔2〕。研究表明，穿心莲内酯及其衍生物穿琥宁注射液、莲必治注射液、病毒净滴眼液、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯等均具有消炎抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗心血管疾病、保肝利胆等功效，最显著的为免疫刺激作用〔3,4〕。有研究报道，穿心莲内酯可通过刺激机体产生各种免疫活性物质而发挥作用，具有调节机体非特异免疫功能，其对自然杀伤(NK)细胞、细胞因子的分泌具有调节作用〔5〕。但穿心莲内酯的免疫调节作用未十分清楚。肠道菌群会产生大量的代谢酶，不同种类的细胞产生不同的代谢酶，不同的酶参与不同的药物代谢。这些细菌可通过药物活化使无活性的药物转化为有活性药物，同时使有害物质无毒化，改善肠道菌群〔6〕。中药和肠道菌群的相互作用对研究中药药效具有重要作用〔7〕。但穿心莲内脂对肠道菌群的调节机制尚未完全清楚。本研究将建立氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠模型，观察高剂量和低剂量的穿心莲内酯对小鼠巨噬细胞吞噬、肠道菌双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌含量的影响，揭示穿心莲内酯可提高机体非特异性免疫力及改善肠道菌群，将可为穿心莲内酯的临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 昆明种小鼠60只(18～20 g)购自北京维通利华实验动物公司。

1.2主要药材、试剂 穿心莲内酯购于天津汇绿公司，纯度98%，批号：170825；肠杆菌培养基(VRPD)、双歧杆菌选择性培养基(BBL)、乳酸细菌培养基(MRS)、大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)培养基均购自北纳生物；氢化可的松注射液购自上海信宜药厂，批号:160316；可溶性淀粉，天津市大茂化学试剂厂，批号：20170613；肿瘤坏死因子(TNF)-α检测试剂盒、白细胞介素(IL)-6检测试剂盒、干扰素(IFN)-γ检测试剂盒均购自碧云天。

1.3氢化可的松诱导免疫抑制小鼠模型的建立 随机选取20只小鼠分为模型组、对照组。模型组小鼠灌胃氢化可的松，2次/d，0.2 ml/次(100 mg/kg)，连续3 d，制造小鼠免疫抑制模型；对照组灌喂等量生理盐水。3 d后断颈法处死小鼠，解剖摘取脾脏和胸腺，分别称重并记录。模型组小鼠的脾脏胸腺指数=脾脏重量(mg)/胸腺重量(g)。

1.4对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬的测定 用超纯水100 ml加入可溶性淀粉1 g充分溶解，于121℃高压灭菌20 min，自然冷却后4 ℃保存备用。抽取鸡血5 ml，加入抗凝剂，1 500 r/min离心3 min,弃去上清，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，再次离心3 min。压积细胞制备10 %红细胞悬液。取40只小鼠随机分成4组，每组10只，标记为对照组、模型组、高剂量穿心莲内酯组、低剂量穿心莲内酯组。按1.3方法对高剂量穿心莲内酯组、低剂量穿心莲内酯组和模型组建立小鼠免疫抑制模型，第4天开始，连续3 d，固定每日上午灌胃高剂量(200 mg/kg)和低剂量(100 mg/kg)的穿心莲内酯，模型组腹腔注射等量的生理盐水，对照组不做处理。第7天下午各组腹腔注射5 %无菌淀粉注射液0.5 ml，1 h后注射10 %鸡红细胞悬液1 ml，间隔1 h将小鼠处死，吸取腹腔渗出液涂片，瑞氏染色计数吞噬百分率。

1.5对免疫抑制小鼠肠道菌群的测定 采取各组小鼠肠道内容物于1 ml无菌EP管，取1 g置于装有9 ml无菌无氧稀释液的稀释管中，充分摇荡10 min，以此为第1管(10-1)，从中取1 ml注入第2管，以此类推，直至第10 管(10-10)。 测定双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌的含量。双歧杆菌用BBL培养基厌氧培养，肠杆菌用VRPD培养基培养，乳酸杆菌用MRS培养基培养，肠球菌用TSA培养基培养，均在37 ℃培养箱中培养48～72 h。采用平板菌落计数法统计细菌量，最后用每克新鲜样品中细菌个数的对数表示。

1.6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量 按照TNF-α检测试剂盒、IL-6检测试剂盒、IFN-γ检测试剂盒操作要求检测巨噬细胞中IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量

1.7统计学分析 采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1氢化可的松诱导免疫抑制小鼠模型 与对照组相比，模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数显著降低(P<0.05)。见表1。氢化可的松成功诱导小鼠免疫抑制。

2.2氢化可的松对小鼠巨噬细胞吞噬能力及血清免疫因子表达的影响 与对照组比较，模型组巨噬细胞吞噬率显著降低(P<0.05)，巨噬细胞吞噬指数显著降低(P<0.05)，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均显著降低(P<0.05)。见表2。

表1 氢化可的松对免疫小鼠免疫器官质量的影响

表2 氢化可的松对小鼠巨噬细胞的吞噬能力、血清免疫因子表达及肠道菌群的影响

2.3氢化可的松诱导小鼠肠道菌群失调 与对照组比较，模型组双歧杆菌、乳酸杆菌含量显著降低，肠杆菌、肠球菌含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.4穿心莲内酯可逆转氢化可的松对小鼠巨噬细胞吞噬能力及血清免疫因子表达的作用 低剂量穿心莲内酯组、模型组与对照组比较，巨噬细胞吞噬率均显著降低(P<0.05)，吞噬指数显著降低，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均显著降低(P<0.05)；高剂量穿心莲内酯组与对照组比较，巨噬细胞吞噬率和吞噬指数无明显差异，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均显著降低(P<0.05)；高剂量穿心莲内酯组、低剂量穿心莲内酯组与模型组比较，细胞吞噬率和吞噬指数显著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均显著升高(P<0.05)； 高剂量穿心莲内酯组与低剂量穿心莲内酯组比较，细胞吞噬率和吞噬指数显著升高，IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均显著升高(P<0.05)。见表3。

表3 穿心莲内酯对氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

与对照组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05；与低剂量穿心莲内酯组比较:3)P<0.05；表4同

2.5穿心莲内酯改善氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠肠道菌群失调 低剂量穿心莲内酯组、模型组与对照组比较，双歧杆菌、乳酸杆菌含量均显著降低，肠杆菌、肠球菌含量均显著升高(P<0.05)；高剂量穿心莲内酯组与对照组比较，双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌含量均无显著差异(P>0.05)，高剂量穿心莲内酯组、低剂量穿心莲内酯组与模型组比较，双歧杆菌、乳酸杆菌含量均显著升高，肠杆菌、肠球菌含量均显著降低(P<0.05)；高剂量穿心莲内酯组与低剂量穿心莲内酯组比较，双歧杆菌、乳酸杆菌含量均显著升高，肠杆菌、肠球菌含量均显著降低，具有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 穿心莲内酯改善氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠肠道菌群失调

3 讨 论

随着我国中药药理研究的深入，穿心莲已为我国中药现代化的产业开发的重要产品〔8〕。早在10年前《美国草药典》已对穿心莲内酯等主要穿心莲药用成分做出规定，标志穿心莲正式进入欧美市场〔9〕。机体的免疫系统包括特异性免疫和非特异性免疫，其中非特异性免疫是人类在长期的进化过程中建立起来的天然防御机制，其主要由机体屏障结构、吞噬细胞、体液中的抗微生物物质发挥功能〔10〕。机体内具有吞噬功能的细胞均称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞，即外周血中的中性粒细胞，大吞噬细胞，即血液中的单核细胞、组织中的巨噬细胞、单核细胞，其均对体内衰老死亡细胞和异物具有吞噬功能〔11〕。吞噬细胞实验通常指大吞噬细胞的检测实验，判断机体的非特异性免疫。早在2009年吕世明等〔12〕在研究呼吸道非特异性免疫中，用鼠伤寒沙门菌滴鼻建立小鼠肺损伤模型，通过对穿心莲内酯处理小鼠的肺指数、吞噬细胞吞噬力、溶菌酶活性、T淋巴细胞活性综合评分，揭示穿心莲内酯可提高小鼠呼吸道非特异性免疫水平。由于穿心莲的水溶性差，导致体外研究的结果不理想，但穿心莲内酯的体内治疗作用是公认的。早在1986年黄添友等〔13〕研究报道，穿心莲内脂可使小鼠胸腺萎缩，外周血T淋巴细胞减少，降低腹腔渗出细胞(PFC)数和血清绵羊红血球(SRBC)抗体效价及迟发型变态反应。20年后彭光勇等〔14〕发现，莲必治注射液可提高豚鼠单核巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬率及人外周血中NK细胞杀伤K562细胞的活性，诱导人外周血单核细胞产生IFN-α、IFN-γ、TNF-α。江冬青等〔15〕在研究穿心莲时也发现，中药穿心莲对人类的免疫功能具积极有影响。本研究检测了穿心莲治疗的氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠的脾脏胸腺指数和吞噬细胞吞噬能力发现，高剂量穿心莲内酯可恢复小鼠吞噬细胞的吞噬能力至对照组水平，提示高剂量穿心莲可明显提高机体非特异性免疫，为穿心莲内酯的用于临床治疗提供用药参考。

肠道微生物是人类健康和疾病的重要决定因素，这些微生物分为两类，即有害菌、有益菌〔16〕，其总体数量约为100万亿个细菌，包括30个属的500多种菌。肠道菌大多为厌氧菌，其中双歧杆菌和乳酸杆菌为肠道主要有益菌，与其他厌氧菌一起保持肠道正常微生态平衡〔17〕。当机体在环境污染、手术外伤、精神不佳、免疫抑制剂、抗癌剂等不利因素下会导致机体免疫力下降，使致病菌肠杆菌、肠球菌大量繁殖，双歧杆菌、乳杆菌有益菌减少，造成肠道菌群紊乱，低机体天然免疫〔18〕。20世纪初，研究者发现，穿心莲可改善草鱼肠道菌群平衡〔19〕，可体外抑制铜绿假单胞菌系统使肝硬化大鼠肠道细菌感染患者受益〔20〕。Gao等〔21〕发现，穿心莲模型的肺损伤脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠能够明显减轻。史艳平等〔22〕研究报道，炎琥宁注射液联合思联康应用，具有清热燥湿、抗病毒、调节肠道菌群平衡的作用，对婴儿病毒性肠炎具有较好的疗效。本研究检测了穿心莲治疗氢化可的松诱导的免疫抑制小鼠肠内容物中双歧杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌、肠球菌含量与未处理小鼠比较发现，穿心莲内酯可提高肠道菌群有益菌的含量，提示穿心莲内酯具有改善肠道菌群作用。这些结果为穿心莲内酯的临床应用提供更充分的实验数据支持。

综上所述，穿心莲内酯可提高机体免疫力，改善肠道菌群，这些发现将为中药穿心莲的临床应用提供科学依据。