miR-216靶向调控HMGA2对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响

曾康康，郑蓉，刘永珍，贺敏

(十堰市太和医院，湖北十堰442700)

宫颈癌是威胁女性健康的第二大常见恶性肿瘤，全世界每年新发病例达52万、死亡病例约26万[1，2]。有研究报道，侵袭和转移是导致宫颈癌临床治疗失败和患者死亡的主要原因[3，4]。但目前对宫颈癌侵袭和转移的分子机制尚不清楚。因此，从分子水平上探索宫颈癌侵袭和转移的机制具有重要意义。微小RNA(miRNA)是一类长度由18～26个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA。研究证实，miRNA与恶性肿瘤密切相关，可作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤的发生、发展[5，6]。miR-216属于miRNA家族成员之一。有研究报道，在多种肿瘤组织中miR-216异常表达，且其异常表达与肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移密切相关。如在胶质瘤组织中miR-216过表达，其过表达可促进肿瘤细胞增殖和迁移[7]；在胰腺导管腺癌组织中miR-216低表达，其低表达能够促进肿瘤细胞侵袭[8]。越来越多研究报道，在宫颈癌患者体内存在多种差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA可作为癌基因或抑癌基因发挥作用[9，10]。Zhu等[11]研究报道，在宫颈癌组织中miR-216表达降低，并能与长链非编码RNA SNHG16组成SNHG16/miR-216/ZEB1信号轴，从而促进宫颈癌细胞迁移。因此推测，miR-216在宫颈癌中可能具有抑癌基因作用。2017年6月～2018年12月，我们观察了miR-216表达变化对宫颈癌细胞侵袭和迁移的影响，并探索了其靶向调控基因。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人宫颈癌细胞株SiHa、HeLa、CaSki及人正常宫颈上皮细胞H8(以下分别称SiHa、HeLa、CaSki、H8细胞)，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。miR-216及其内参GAPDH引物序列，由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。miR-216 mimics、miR-216 NC，由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成。野生型和突变型高迁移率族蛋白A2(HMGA2) 3′UTR荧光素酶报告基因载体(HMGA2 WT、HMGA2 MUT)，由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。7500型荧光定量PCR仪，美国ABI公司；NanoDrop 2000超微量核酸分析仪，美国Thermo公司；蛋白电泳仪，美国Bio-Rad公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司；双荧光素酶活性检测试剂盒，北京艾然生物科技有限公司。兔抗人HMGA2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗及HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，美国Abcam公司。

1.2 人宫颈癌细胞筛选 将SiHa、HeLa、CaSki、H8细胞接种于含10% FBS的DMEM高糖培养基，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。当细胞融合80%以上时，胰蛋白酶消化，按1∶3传代。取传2代、对数生长期、生长状态良好细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经NanoDrop 2000超微量核酸分析仪鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明进行PCR扩增。PCR反应体系共10 μL：cDNA模板2 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 5 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.2 μL，ddH2O 2 μL；反应条件：95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s共30个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。取miR-216相对表达量最低的宫颈癌细胞进行后续实验。

1.3 上调miR-216表达对宫颈癌细胞侵袭、迁移能力及MMP-2、MMP-9蛋白表达影响的检测

1.3.1 细胞转染与转染效率验证 取上述miR-216相对表达量最低的宫颈癌细胞，接种于含DMEM高糖培养基的6孔板中，每孔1×105个。随机将细胞分为观察组和对照组，每组设3个复孔，然后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，观察组与对照组分别转染miR-216 mimics、miR-216 NC。转染8 h，更换新的DMEM高糖培养基继续转染16 h，收集细胞。采用RT-qPCR法检测两组转染效率。

1.3.2 细胞侵袭和迁移能力检测 ①Transwell迁移实验：收集两组转染后细胞，胰蛋白酶消化，用无血清培养基吹打成单细胞悬液。将Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用PBS提前润湿5 min，上室加入宫颈癌细胞5×104个，下室加入含10% FBS的DMEM完全培养基。然后将Transwell小室置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养6 h，取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定10 min，苏木素染色20 min，显微镜下观察。随机选取5个100倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞迁移能力。实验重复3次，取平均值。②Boyden侵袭实验：实验前2 h将Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用基底胶包被，其余步骤同Transwell迁移实验。

1.3.3 MMP-2、MMP-9蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集两组转染后细胞，RIPA裂解液冰上充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。然后加入5倍的上样缓冲液，100 ℃水浴5 min，使蛋白充分变性。取变性蛋白50 μg，SDS-PAGE(10%浓缩胶、5%分离胶)分离蛋白，采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF膜上，8%脱脂奶粉封闭3 h，分别加入兔抗人HMGA2、MMP-2、MMP-9、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜。次日，加入山羊抗兔IgG二抗，室温孵育2 h，ECL发光，暗室中曝光、显影。采用EPSON扫描仪扫描各蛋白电泳条带灰度值。以GAPDH为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 miR-216靶向调控HMGA2检测 采用TargetScan软件(http：//www.targetscan.org/vert_72/)预测HMGA2 3′UTR与miR-216的结合位点。取上述miR-216相对表达量最低的宫颈癌细胞，接种于24孔板，每孔2×104个。随机分为4组：miR-216 mimics+HMGA2 WT组、miR-216 mimics+HMGA2 MUT组、miR-216 NC+HMGA2 WT组、miR-216 NC+HMGA2 MUT组，每组设3个复孔，然后置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。培养24 h，miR-216 mimics+HMGA2 WT组转染miR-216 mimics和HMGA2 WT，miR-216 mimics+HMGA2 MUT组转染miR-216 mimics和HMGA2 MUT，miR-216 NC+HMGA2 WT组转染miR-216 NC和HMGA2 WT，miR-216 NC+HMGA2 MUT组转染miR-216 NC和HMGA2 MUT。转染8 h，更换新的DMEM高糖培养基继续转染16 h，按双荧光素酶活性检测试剂盒说明检测荧光素酶活性。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞miR-216表达比较 HeLa、SiHa、CaSki、H8细胞miR-216相对表达量分别为1.24±0.32、3.02±0.33、2.84±0.38、5.76±0.78，HeLa、SiHa、CaSki细胞miR-216相对表达量均明显低于H8细胞(P均<0.05)。在宫颈癌细胞中以HeLa细胞miR-216相对表达量最低，故选择HeLa细胞进行后续实验。

2.2 两组miR-216表达比较 观察组与对照组miR-216相对表达量分别为22.68±6.25、1.00±0.00，两组比较P<0.05。

2.3 两组细胞侵袭和迁移能力比较 Transwell迁移实验时，观察组与对照组穿膜细胞数分别为(32.48±4.23)、(73.21±8.37)个，两组比较P<0.05。Boyden侵袭实验时，观察组与对照组穿膜细胞数分别为(21.17±3.42)、(46.43±4.65)个，两组比较P<0.05。

2.4 两组MMP-2、MMP-9蛋白表达比较 观察组与对照组MMP-2蛋白相对表达量分别为0.13±0.09、1.00±0.03，MMP-9蛋白相对表达量分别为0.21±0.05、1.02±0.02。两组比较P均<0.05。

2.5 miR-216与HMGA2的靶向调控验证 TargetScan软件预测显示，miR-216与HMGA2 3′UTR存在互补结合位点，即HMGA2是miR-216的靶基因。见图1。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-216 mimics+HMGA2 WT组与miR-216 NC+HMGA2 WT组荧光素酶活性分别为0.35±0.18、0.843±0.25，两组比较P<0.05；miR-216 mimics+HM-GA2 MUT组与miR-216 NC+HMGA2 MUT组荧光素酶活性分别为0.73±0.21、0.74±0.15，两组比较P>0.05。

图1 miR-216与HMGA2 3′UTR的结合位点示意图

3 讨论

宫颈癌是临床常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其发病率居女性恶性肿瘤的第二位，在某些发展中国家甚至居首位。尽管宫颈癌手术、放化疗等治疗手段日趋完善和成熟，但患者预后并无明显改善，尤其是晚期或转移性宫颈癌[12，13]。目前认为，侵袭和转移是导致宫颈癌患者死亡的重要原因[14]，但其侵袭和转移的分子机制尚不十分清楚。因此，探索宫颈癌侵袭和转移的分子机制，有可能为宫颈癌治疗提供潜在的分子靶点。

miRNA是一类长度由18～26个核苷酸组成的内源性非编码单链小分子RNA，虽然不具备编码蛋白质的功能，但其表达失调可引起包括肿瘤在内的多种疾病[15]。越来越多研究表明，miRNA在调控肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭和迁移过程中具有重要作用，几乎涉及所有恶性肿瘤的发生、发展过程[16，17]。miR-216是miRNA家族的重要一员，定位于人染色体2p16.1。有研究报道，miR-216在胶质瘤、肝癌、胃癌等实体肿瘤中低表达，其低表达可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学行为[7，18，19]。而在急性髓性白血病患者骨髓中miR-216高表达，其高表达与患者预后不良有关[20]。这些研究结果表明，miR-216在不同肿瘤中发挥的作用不同。Zhu等[11]报道，在宫颈癌组织中miR-216表达降低，其低表达能促进肿瘤侵袭和转移。因此推测，miR-216在宫颈癌中可能具有抑癌基因作用。本研究首先观察了宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞miR-216表达，结果发现，HeLa、SiHa、CaSki细胞miR-216相对表达量均明显低于H8细胞，提示miR-216在宫颈癌细胞中的表达低于正常宫颈上皮细胞，与Zhu等[11]报道一致。本研究选择miR-216相对表达量最低的HeLa细胞进行后续实验，采用瞬时转染技术分别转染miR-216 mimics、miR-216 NC，经RT-qPCR法验证，该技术成功使HeLa细胞miR-216过表达，进一步研究发现，过表达miR-216的HeLa细胞侵袭和迁移能力均明显降低，提示miR-216过表达能够抑制宫颈癌细胞侵袭和迁移。

肿瘤的侵袭和转移是一个错综复杂的过程，这一过程不仅有多种基因参与，还受一些相关因子、酶类和蛋白质等影响和调控。MMPs是一类锌离子依赖性肽链内切酶，通过降解细胞外基质与基底膜，参与肿瘤细胞的侵袭和迁移[21]。MMP-2、MMP-9是MMPs家族的重要成员。MMP-2属于非糖化明胶酶，能够通过降解细胞外基质、促进新生血管生成、调节细胞间黏附等，促进肿瘤细胞侵袭和迁移。MMP-9属于明胶酶，通过降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原及弹性蛋白和纤维连接蛋白等，促进肿瘤细胞侵袭和迁移[22]。因此，MMP-2、MMP-9在恶性肿瘤组织中高表达。有研究发现，miRNA能够调控MMP-2、MMP-9表达，如上调miR-93-5p表达能够增强MMP-2、MMP-9表达，继而促进宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移[10]。但miR-216是否通过调控MMP-2、MMP-9表达参与宫颈癌细胞侵袭和迁移尚不清楚。本研究采用Western blotting法检测了转染miR-216 mimics、miR-216 NC的HeLa细胞MMP-2、MMP-9表达，结果发现过表达miR-216的HeLa细胞MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量明显降低，表明miR-216可通过调控MMP-2、MMP-9表达抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移。

miRNA能够通过抑制mRNA的降解或翻译，调控靶基因转录后表达，继而干预下游信号转导，从而发挥相应的生物学作用。为了寻找miR-216的靶向调控基因，本研究采用TargetScan软件进行预测，结果发现miR-216与HMGA2 3′UTR存在互补结合位点，即HMGA2是miR-216的靶基因。HMGA2属于非组蛋白染色体中高迁移率蛋白家族的一员，其基因定位于人染色体12q13-15，由5个外显子和4个内含子组成。HMGA2可通过改变染色体的结构和通过与靶基因DNA或蛋白质相互作用而发挥相应的生物学功能[23]。已有研究证实，HMGA2能够促进肿瘤的发生、发展[24，25]。在宫颈癌细胞中HMGA2表达升高，其高表达可促进肿瘤的侵袭和转移[26]，但其具体机制尚不清楚。为了探索miR-216与HMGA2的靶向调控关系，本研究采用双荧光素酶报告基因实验检测了miR-216 mimics+HMGA2 WT组、miR-216 mimics+HMGA2 MUT组、miR-216 NC+HMGA2 WT组、miR-216 NC+HMGA2 MUT组荧光素酶活性，结果发现，miR-216 mimics+HMGA2 WT组荧光素酶活性低于miR-216 NC+HMGA2 WT组，而miR-216 mimics+HMGA2 MUT组与miR-216 NC+HMGA2 MUT组荧光素酶活性比较差异无统计学意义，提示miR-216可能是通过靶向调控HMGA2进而抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移。

综上所述，miR-216能够通过靶向调控HMGA2抑制宫颈癌细胞侵袭和迁移，这为中晚期宫颈癌治疗提供了新的思路。