金匮肾气丸对糖尿病复合脑缺血模型大鼠认知功能障碍的影响及其机制研究

王玲玉 谭涛 陈伟燕

[摘要] 目的 探讨金匮肾气丸对于糖尿病复合脑缺血模型大鼠认知功能的影响及其机制。 方法 将SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。正常对照组用普通基础饲料饲养，模型组用高脂高糖饲料饲养，30 d后建立2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠，对糖尿病大鼠施以双侧颈动脉缺血再灌手术诱导糖尿病脑病模型。将模型组大鼠随机分为糖尿病模型组、金匮肾气丸组及二甲双胍组，采用Morris水迷宫实验对动物行为学进行评价，处死大鼠后取脑海马组织，采用Western blot法检测各组大鼠海马神经元Ng和mGluR5蛋白表达情况。 结果 水迷宫实验结果显示，与糖尿病模型组比较，金匮肾气丸组及二甲双胍组大鼠逃避潜伏期和探索距离缩短（P<0.05或P<0.01），目标象限游泳时间显著延长，站台穿越次数显著增加（P<0.05）;大鼠海马神经元中Ng和mGluR5蛋白表达恢复，并且呈剂量依赖性。 结论 金匮肾气丸可明显改善糖尿病脑病模型大鼠认知障碍，并增强其大脑海马区Ng和mGluR5蛋白表达。

[关键词] 糖尿病脑病;金匮肾气丸;Ng;mGluR5

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2019）24-0037-04

[Abstract] Objective To explore the effects of Jingui Shenqi Wan on cognitive dysfunction and its mechanism in rats with diabetes mellitus combined with cerebral ischemia. Methods SD rats were randomly divided into normal control group and model group. The normal control group was fed with normal basal diet， the model group was fed with high-fat and high-sugar diet， and the insulin-resistant rats with type 2 diabetes were established 30 days later. Diabetic encephalopathy models were induced by bilateral carotid ischemia-reperfusion surgery in diabetic rats. Rats in the model group were randomly divided into the diabetic model group， the Jingui Shenqi Wan group and the metformin group. Morris water maze test was used to evaluate the behavior of the rats. The rats were sacrificed and the hippocampus was taken. The expression of Ng and mGluR5 protein in hippocampal neurons of each group was detected by Western blot. Results The results of the water maze test showed that compared with the diabetic model group， the escape latency and exploration distance（P<0.05 or P<0.01） of the Jingui Shenqi Wan group and the metformin group were shortened， the target quadrant swimming time was significantly prolonged and the number of increased station crossings was significantly increased（P<0.05）; The Ng and mGluR5 protein expression was restored in rats' hippocampal neurons in a dose-dependent manner. Conclusion Jingui Shenqi Wan can significantly improve the cognitive impairment of diabetic encephalopathy model rats and enhance the expression of Ng and mGluR5 protein in hippocampus of the brain.

[Key words] Diabetic encephalopathy; Jingui Shenqi Wan; Ng; mGluR5

糖尿病腦病是糖尿病晚期比较常见的合并症，其发生机制可能与长期高血糖刺激引起脑神经细胞加速老化相关，该类疾病主要临床症状为认知功能障碍，包括智力减退、健忘、反应迟钝等，同时也会出现脑组织形态异常等病理学改变[1]。目前该病没有较为有效的治疗手段，主要是在控制患者血糖水平的基础上配合使用脑血管扩张剂，如尼莫地平等以及一些神经营养剂[2]，但其效果并不明显，故寻求其他安全有效的药物具有现实意义。近年来，中医药治疗糖尿病脑病取得了长足的进展，尤其是金匮肾气丸在治疗糖尿病及其并发症方面均有明显疗效[3，4]，但是其具体机制研究尚少，故本实验拟从金匮肾气丸对糖尿病脑病干预作用入手，进一步探讨糖尿病脑病的治疗作用及其发病机制，为糖尿病脑病治疗提供新方案和理论思路。

1 材料与方法

1.1 一般材料

2016年3月16日～12月27日进行实验，链脲佐菌素（Sigma公司，美国，批号2060675），金匮肾气丸（北京同仁堂，国药准字Z11020147，规格20 g/100粒），二甲双胍缓释片（成都恒瑞制药有限公司，国药准字H20030952，规格0.5 g×10片/盒）。健康雄性SD大鼠由浙江中医药大学实验动物中心提供，Ng、mGluR5和β-actin一抗抗体及其相应二抗均购自Santa Cruz公司，实验所需的各项仪器和设备则由浙江中医药大学基础医学院提供。

1.2 模型制备及分组

将32 只健康雄性SD大鼠随机分为正常组（n=8）和模型组（n=24）。正常组仅普通基础饲料喂食，自由摄食饮水;模型组则以高脂高糖饲料喂食（高脂配方：基础饲料65%、猪油10%、蛋黄粉10%、全脂奶粉10%、蔗糖5%），自由摄食饮水;造模30 d后禁食12 h，模型组大鼠按50 mg/kg体重左下腹腔注射链脲佐菌素，正常组大鼠按同剂量左下腹腔注射柠檬酸盐缓冲液。造模7 d后，大鼠尾静脉取微量血，用强生公司One-Touch Ultra血糖仪检测血糖，尿糖以试纸检测定性。当血糖>16.7 mmol/L合并尿糖（+++）为糖尿病大鼠模型造模成功，造模4 d后行双侧颈动脉缺血再灌注手术复合造模，将大鼠麻醉后分离出颈总动脉用动脉夹夹闭15 min，放开5 min，再夹15 min后放开，局部给予青霉素后缝合皮肤。造模成功后，模型组大鼠随机分为糖尿病模型组、金匮肾气丸组及二甲双胍组，每组8只。金匮肾气丸组以金匮肾气丸1.25 g干粉/mL水配置后，10 mL/kg每天给大鼠灌胃1次，二甲双胍组以二甲双胍缓释片2.0 g干粉/mL溶于水，10 mL/kg每天给大鼠灌胃1次，均灌胃治疗30 d。剔除及纳入标准：动物苏醒后进行神经功能评分，按照Zausinger六分法[5]对其神经功能进行评分，根据评分结果进行下一步实验。去除无神经功能缺损及病情过轻和过重的模型，即评分为 0、4 和 5 分的大鼠，评分为 1、2、3 分的均视为模型成功。

1.3 Morris水迷宫实验

主要由圆形水池和自动摄象及电脑分析系统组成Morris水迷宫测定大鼠记忆功能：①定位航行实验：每组大鼠灌胃1 h后开始，每天分为上午和下午2个时段，每个时段分别训练4次，每次从4 个不同的标记点（标记点平均分布于4个象限），将各组大鼠面朝池壁置于水中，分别记录其在90 s 内寻找到平台所需的时间（即逃避潜伏期）和搜索距离。每次训练间隔30 min，共训练4 d，保持平台位置不变。如果90 s内仍未寻找到平台，则将大鼠重新置于平台，并于20 s后移出迷宫，其潜伏期计为90 s。②空间探索实验：4 d后撤除平台，将大鼠任选1个入水点面向池壁置于水中，记录在90 s内大鼠穿越虚拟平台的次数及其在目标象限（原站台象限）的游泳时间。

1.4 Western blot法检测Ng和mGluR5蛋白表达

取下各组大鼠海马脑组织，提取蛋白质电泳后转膜，先将膜与一抗4℃孵育过夜，后在室温下与二抗孵育1～2 h，TBST洗后发光显影，以β-actin为内参，一抗浓度分别为Ng（1∶500）、mGluR5（1∶500）、β-actin（1∶1000）;二抗浓度（1∶1000）。结果通过Image J软件测定灰度值，并分别计算Ng或mGluR5蛋白表达灰度值= Ng或mGluR5灰度值/对应β-actin灰度值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件处理分析数据，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，或采用重复测量方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金匮肾气丸对糖尿病复合脑缺血模型大鼠潜伏期的影响

Morris水迷宫结果显示，糖尿病复合脑缺血模型组大鼠寻找以及到达站台的游动时间（即逃避潜伏期）较正常组大鼠明显增加，而金匮肾气丸组及二甲双胍组大鼠则均较糖尿病模型组改善，且随着时间推移，差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01），见表1。

2.2 金匮肾气丸对糖尿病复合脑缺血模型大鼠水迷宫试验的影响

与正常组相比，糖尿病模型组大鼠探索距离增长，而在目标象限（Ⅱ象限）的游泳时间变短，站台穿越次数减少;但经金匮肾气丸及二甲双胍治疗后大鼠探索距离、目标象限（Ⅱ象限）游泳时间及站台穿越次数均有明显恢复（P<0.05或P<0.01），见表2。

2.3 金匮肾气丸对糖尿病复合脑缺血模型大鼠脑海马组织中Ng和mGluR5蛋白表达影响

Western blot结果显示，与正常组比较，糖尿病模型组大鼠海马中Ng和mGluR5蛋白表达明显降低（P<0.01）;而金匮肾气丸组及二甲双胍組大鼠海马组织Ng和mGluR5蛋白表达与糖尿病模型组比较，有明显增高（P<0.05），见表3及图1～3。

3 讨论

糖尿病作为现在常见多发性疾病，其并发症是患者最主要的死亡原因，并逐渐引起关注。临床及动物研究均已证实，糖尿病可诱导中枢神经系统功能障碍，患者常出现学习记忆能力减退，最终导致糖尿病人群在老年痴呆的发病率显著高于其他人群[6，7]。糖尿病脑病作为糖尿病主要并发症之一，严重危害患者健康，但却缺乏有效的防治手段[8，9]。糖尿病属于中医“消渴”范畴，气血阴阳失衡，变证百出，益气养阴是该病最基本的治疗方法[10，11]。金匮肾气丸可温肾阳、滋肾阴，取其阴中求阳之法，以山药厚其土以藏之，山茱萸肉敛其气以秘之，牡丹皮、泽泻和茯苓则引亢火以归之。如此可使肾复其封蛰之职，水中之火，缓缓蒸腾，不亢不衰，温养五脏六腑及四肢百骸，终成水火既济之象[12，13]。

目前关于糖尿病脑病发病机制的研究较少，推测可能与海马神经元相关蛋白表达失调有关。海马作为主导学习和记忆的关键部位，其长时程增强（LTP）是重要的作用基础，该作用依赖于复杂的突触前、后机制，LTP高频刺激后可引起胞内蛋白激酶C（PKC）等的表达[14]，而Ng作为一种新发现的脑特异性突触后蛋白，是PKC的天然作用底物[15]。Ng在生理状态下主要与CaM结合形成复合体，但PKC可使该复合物发生磷酸化、氧化及谷胱甘肽化等化学修饰，参与学习记忆功能和LTP等突触可塑性机制，因而可能在学习记忆的形成和巩固中发挥重要作用[16]。此外mGluR5作为主要分布于皮层、纹状体及海马等突触后膜的神经递质，可以通过调节突触后膜释放谷氨酸和多巴胺，进而参与调节神经通路活性[17]，并与学习记忆也密切相关[18]。有实验证实，如往大鼠脑室内注射mGluR5阻滞剂可导致海马长时程增强（LTP）抑制的发生，并同时损害大鼠空间记忆水平[19]，而通过腹腔注射mGluR5变构增强剂则可显著改善海马相关的空间记忆[20]，并证实大鼠记忆水平情况与其海马mGluR5的蛋白表达水平存在正相关[21]。

本实验结果显示，与正常组比较，模型组大鼠游出时间和错误次数均明显增多，提示糖尿病复合脑缺血模型大鼠学习记忆功能减退，该病可造成大鼠海马神经元细胞中Ng和mGluR5表达显著下降，可能也是该病引起认知功能障碍的关键途径。而经过金匮肾气丸及二甲双胍治疗后的大鼠，其海马神经元细胞中Ng和mGluR5表达明显回升，潜伏期及错误次数均有显著改善，提示金匮肾气丸对糖尿病复合脑缺血模型大鼠的学习记忆有明显改善作用，其机制可能是通过恢复海马神经元细胞中Ng和mGluR5的表达来实现的。

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（收稿日期：2018-09-14）