组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对小鼠T淋巴瘤细胞EL4中miR-150表达及增殖的影响

肖刚峰 任富鹏

非特指型外周T细胞淋巴瘤是一组异质性很强的淋巴系统恶性疾病，是常见的非霍奇金淋巴瘤亚型。其治疗进展缓慢，预后较差。非特指型外周T细胞淋巴瘤的发病机制迄今为止尚未得到完全阐明。miR-150作为肿瘤抑制miRNA在多种恶性肿瘤中发生异常表达，介导多种肿瘤的发生、发展及转移[1]。近年来有研究发现miR-150在T细胞淋巴瘤低表达[2]，但其低表达的原因尚不清楚。最新研究资料揭示，表观遗传可调控microRNA表达，且乙酰化修饰是重要的表观遗传修饰方式之一[3-4]。我们推测表观遗传机制中的组蛋白去乙酰化酶的激活可能是抑制microRNA表达的原因，且研究亦发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACi）作为新型抗肿瘤药物在体内外均有抗肿瘤作用。辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA）是第二代氧肟酸类HDACi，本研究探讨HDACi SAHA对小鼠T淋巴瘤细胞EL4中miR-150表达的影响，以及对肿瘤细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料 小鼠淋巴瘤细胞（EL4）购于中国科学院上海细胞库。二甲基亚砜（DMSO）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）购于美国SIGMA公司；1640培养液购于GIBCO公司。胎牛血清购于中国科学院生物工程研究所。SAHA购自美国Sigma-Aldrich公司。Trizol试剂购自Invitrogen公司，TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit购自Applied Biosystems公司。miR-150引物、U6引物由Primer 5.0设计并购自上海百力格生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的1640培养液培养 EL4细胞，条件为5%CO2，37℃。

1.2.2 SAHA处理EL4细胞 将5×105/ml EL4细胞接种于6孔板各孔中，细胞进行无血清同步化处理后加入0.25、0.5、1μmol/L SAHA 孵育 32h。将 SAHA 处理过的EL4细胞洗脱、离心，定量 RT-PCR法测定细胞中miR-150的表达水平。

1.2.3 定量RT-PCR测定细胞中miR-150的表达水平 收集细胞，用Trizol提取总RNA，分管光度计测定浓度。分别通过miR-150和U6特异性引物，利用Taq－ManMicroRNA Reverse Transcription Kit合成 cDNA，进行 qRT-PCR（ABIPRISM 7000 Sequence Detection System）。反应条件：95℃，10min；95℃，15s；60℃，60s；40 个循环；软件分析其Ct值，以U6作为内参，由公式2-ΔCt计算miR-150在各组EL4细胞中的相对表达量。

1.2.4 MTT法测定细胞增殖能力 收集各组细胞，制成细胞悬液并计数。再将等量细胞接种到96孔培养板,每孔加 MTT（5g·L-1）10μl，培养 4h 后,吸弃上清液,再加入 DMSO（150μl），于微量振荡器充分振荡 10min,置酶标仪上于490nm处测吸光度（OD值）。各组细胞的增殖率（%）=实验组平均OD值/对照组平均OD值×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料采用表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组细胞miR-150相对表达量比较 见表1、图1。

表1 4组细胞m i R-150相对表达量比较

图1 4组细胞m i R-150相对表达量比较（与对照组比较，*P＜0.05）

由表1、图1可见，在使用HDACi SAHA来处理EL4细胞后，EL4细胞中miR-150的表达增加（均P＜0.05），且随着SAHA剂量的增加而增加。

2.2 4组细胞增殖情况比较 见表2、图2。

表2 4组细胞增殖情况比较

图2 4组细胞增殖情况比较（与对照组比较，*P＜0.05）

由表2、图2可见，在使用HDACi SAHA来处理EL4细胞后，EL4细胞增殖能力下降（均P＜0.05）。

3 讨论

非特指型外周T细胞淋巴瘤是一组异质性很强的T细胞恶性肿瘤，其确切的发病机制尚未阐明。积极探索本病的发病机制，不仅具有重要的理论意义，而且可能为本病的诊断与治疗提供新的策略。miRNA是一类非蛋白编码小分子RNA，根据其在T淋巴细胞分化以及B细胞淋巴瘤的研究成果[5-7]，可以推测miRNA在外周T细胞淋巴瘤发病中同样发挥着重要的作用。miR-150是长度为22个核苷酸的单链小分子RNA，参与免疫系统和造血系统发生、胚胎发育以及干细胞分化的调节[8-10]。近年来研究发现，miR-150作为肿瘤抑制性microRNA参与包括外周T细胞淋巴瘤在内的多种恶性肿瘤的发生、发展[11-12]。在淋巴及造血系统恶性肿瘤中，其多为低表达。作为肿瘤抑制物，miR-150的低表达使得细胞分化凋亡异常，参与了恶性淋巴瘤的发生、发展。

HDACi是一类具有抗肿瘤活性的新型药物，研究发现其在体内外均有抗肿瘤作用，目前已应用于皮肤T细胞淋巴瘤[13-14]。其抗肿瘤作用的分子机制尚不十分清楚，存在许多问题尚待进一步阐明。我们推测其可能通过恢复或提高关键肿瘤抑制因子如miR-150等表达来起作用。为此，我们使用HDACi SAHA来处理小鼠T淋巴瘤EL4细胞，发现EL4细胞miR-150的表达随着SAHA剂量的增加而增加，表明miR-150的表达可能受到乙酰化修饰的调控，但具体机制有待进一步研究。比如可以通过分析组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）与组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）的变化，同时结合阻断策略来检测miR-150的表达变化，间接验证对miR-150的调控影响。其次，可以用免疫共沉淀技术等方法来直接验证与miR-150的关系，以明确miR-150乙酰化修饰调控的具体机制。在本研究中，我们同时进一步对经HDACi SAHA处理后的EL4细胞增殖能力进行了观察，发现经HDACi SAHA处理后，EL4细胞增殖能力下降，SAHA抗增殖能力呈剂量依赖可能。HDACi下调EL4细胞的增殖能力，我们推测其部分机制可能是通过恢复或提高miR-150的表达来实现。

综上所述，本研究提示，SAHA作为HDACi能够恢复或提高miR-150的表达并有效抑制小鼠T淋巴瘤细胞增殖。本实验结果丰富了对HDACi作用机制的认识，为SAHA应用于非特指型外周T细胞淋巴瘤的临床治疗提供一定的理论依据。