臭氧通过调节HIF-1α-VEGF信号通路治疗类风湿关节炎的实验研究

杨妮娜 詹景棣 柳海晓 许心弦

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性系统性自身免疫性炎症性疾病，其主要病理特征是全身关节滑膜炎及血管翳形成，引起关节软骨及骨破坏，病变范围累及骨骼、肌肉、韧带及滑膜组织，最终导致关节畸形及功能障碍，影响患者生存质量。现有研究表明，RA患者滑膜细胞及滑膜组织中浸润的单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、T淋巴细胞及巨噬细胞等通过自分泌或旁分泌的方式产生大量的细胞因子，其中低氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是导致滑膜炎的重要的细胞因子之一，可与多种形式的细胞受体结合，诱导血管内皮细胞的迁移和血管的新生，促进炎性细胞的浸润，在RA血管翳发生中发挥着重要的作用[1-2]。

近年来在风湿性疾病领域中出现了关于臭氧（ozone，O3）治疗炎症性关节病的研究，结果提示O3具有抑制炎症因子释放、促进滑膜细胞凋亡、镇痛等作用[3-4]，但是其作用机制相关的信号通路研究报道较少。本研究采用O3治疗大鼠RA模型，分析其对大鼠相关细胞因子表达水平的影响，以探索O3治疗RA的可能作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器 牛Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂购于美国 Sigma公司（批号：C7806、105600）；大鼠 HIF-1α、VEGF定量检测试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司（批号：190047-201707、130570-201706）；细胞蛋白提取试剂盒、ECL试剂盒购于美国Beyotime公司（批号：P0033、P0018S）；HIF-1α、VEGF、β-actin 一抗购于美国 Cell Signaling 公司（批号：3716、9943、1025S）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购于美国Thermo Scientific公司（批号：K1022）；Trizol试剂盒、SYBR Green RT-qPCR Kit均购于美国Invitrogen公司（批号：10596018、C11744050）；HIF-1α、VEGF、GAPDH 引物由美国Invitrogen公司设计合成。医用臭氧发生器为德国Hermann公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 健康的SPF级雄性Wistar大鼠30只，体质量180～220g，由温州医科大学动物实验中心提供[SYXK（浙）2010-0150]。所有大鼠采用标准饲料在相同条件下喂养，自由饮食及活动。采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组10只，即对照组（Con组）、RA组和O3组。

1.2.2 大鼠RA动物模型的制备 RA模型的建立采用注射用弗氏完全佐剂乳化的牛Ⅱ型胶原进行诱导。具体过程如下：取牛Ⅱ型胶原蛋白和0.1mol/L冰醋酸溶液配置成质量浓度为2mg/ml的混合液，4℃过夜。次日在冰浴条件下取上述混合液与完全弗氏佐剂按体积比1∶1混合，并研钵至乳白色黏稠液体状，置入乳化器中反复抽推，直至完全乳化，胶原浓度为1mg/ml。RA组和O3组大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量为0.5ml/100g，使用75%乙醇消毒后，将制备好的牛Ⅱ型胶原蛋白乳液1ml分点注入大鼠背部脊柱两侧及尾部皮下，1周后注射0.5ml进行免疫强化，诱导RA模型。Con组不作任何特殊处理。

1.2.3 给药方法 造模成功后，O3组大鼠右膝关节腔注射 O3，1ml/次，1次/周，连续 4周；Con 组和 RA 组右膝关节腔注射0.9%氯化钠溶液，剂量和用法同上。

1.2.4 大鼠右膝关节肿胀率测算 于治疗前后采用软尺测量大鼠右膝关节的周长，每次共测量3遍，取3遍测量结果的平均值，将治疗前后的膝关节周长进行比较，计算膝关节肿胀率[3]。膝关节肿胀率（%）=（治疗后膝关节周长-治疗前膝关节周长）/治疗前膝关节周长×100%。

1.2.5 大鼠血清及关节液HIF-1α、VEGF水平测定 治疗开始前及结束后，抽取大鼠腹腔血5ml，充分离心后分离血清，采用ELISA法检测HIF-1α、VEGF水平，具体操作参考试剂盒使用说明书。治疗结束后另抽取右膝关节液同法检测上述细胞因子水平。

1.2.6 大鼠滑膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达检测 采用Western blot法。实验结束时，颈椎脱位法处死大鼠后，分离右膝关节滑膜组织，-80℃保存备用。取约100mg大鼠右膝关节滑膜组织，加入1ml蛋白匀浆缓冲液，混入1%PMSF后冰浴下匀浆操作。充分离心后取上清液，使用BCA法测定蛋白含量。样本经过SDS-PAGE电泳后，转模、封闭，分别加入 HIF-1α、VEGF、β-actin一抗（稀释比例均为1∶500），4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物标记的二抗（稀释比例1∶2 500），室温下孵化，洗膜后加显色剂显影，使用Image Lab version 3.0分析结果。

1.2.7 大鼠滑膜组织HIF-1α、VEGF mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取大鼠右膝关节滑膜组织，采用Trizol试剂盒提取总RNA，酶标仪检测RNA纯度及浓度。取RNA样品进行逆转录，随后参照试剂盒说明书进行PCR扩增。引物如下：HIF-1α上游引物：GATGAATCAAAAGCAGTGACGAAGG，下游：ATGCCTTAGCAGTGGTCATTTCTTC；VEGF上游引物：CGACAGAAGGGGAGCAGAAAG，下游：GCACTCCAGGGCTTCATCATT；GAPDH 上游引物：TGGAGTCTACTGGCGTCTT，下游：TGTCATATTTCTCGTGGTTCA。反应条件：95℃ 1min 预变性，95℃ 5s，60℃ 60s，最终 72℃ 10min，共40个循环。每次扩增以GAPDH为内参，制作标准曲线，采用 2-ΔΔCt法分别计算 HIF-1α、VEGF mRNA 的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠膝关节肿胀率比较 治疗结束后各组大鼠右膝关节皮肤黏膜完好，无破溃。与Con组比较，RA组和O3组大鼠右膝关节肿胀率明显增高，具有统计学差异（P＜0.05）。与RA组比较，O3组右膝关节肿胀率明显减低，具有统计学差异（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠右膝关节肿胀率比较（注：与C on组比较，*P＜0.05；与 R A 组比较，△P＜0.05）

2.2 各组大鼠血清HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较 治疗开始前，各组大鼠血清中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05）。治疗后，与Con组比较，RA组和O3组大鼠血清中上述细胞因子蛋白表达水平均明显升高，具有统计学差异（P＜0.05），而RA组和O3组血清中上述细胞因子蛋白表达水平无统计学差异（P＞0.05），见图2。

图2 各组大鼠血清H I F-1α、V E G F蛋白表达的水平比较（注：与C on组比较，*P＜0.05；与R A组比较，△P＜0.05）

2.3 各组大鼠关节液HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较 与Con组比较，RA组和O3组大鼠关节液中HIF-1α和VEGF蛋白表达水平明显升高，均具有统计学差异（均P＜0.05）。与RA组比较，O3组HIF-1α和VEGF蛋白表达水平明显降低，均具有统计学差异（均P＜0.05），见图 3。

图3 各组关节液H I F-1α、V E G F蛋白表达的水平比较（注：与C on组比较，*P＜0.05；与R A组比较，△P＜0.05）

2.4 各组大鼠滑膜组织HIF-1α、VEGF蛋白表达水平比较 与Con组比较，RA组和O3组大鼠滑膜组织中HIF-1α和VEGF蛋白表达水平均明显升高，具有统计学差异（P＜0.05）。与RA组比较，O3组HIF-1α和VEGF表达水平均明显降低，具有统计学差异（P＜0.05），见图4、5。

2.5 各组大鼠滑膜组织HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响 与Con组比较，RA组和O3组大鼠滑膜组织中HIF-1α和VEGF mRNA表达水平均明显升高，具有统计学差异（P＜0.05）。与RA组比较，O3组上述因子mRNA表达水平均明显降低，具有统计学差异（P＜0.05），见图6。

图5 各组大鼠滑膜组织H I F-1α、V E G F蛋白表达水平比较

图6 各组大鼠滑膜组织H I F-1α、V E G F m R NA表达水平比较

3 讨论

RA是一种系统性慢性自身免疫性疾病，发病机制复杂。既往研究显示，关节腔内滑膜炎性增生及大量血管翳形成是其特征性病理改变，而VEGF的分泌能够促进滑膜中大量血管新生，对血管翳的形成起着重要作用[5-6]。研究发现，RA患者关节液和血清中VEGF呈高表达状态，提示其与RA的进展过程关系密切，通过与VEGF受体相结合，能够激活下游信号通路，促使血管细胞内皮增殖、分化和迁移，产生大量新生血管并提高血管通透性，加速滑膜炎性增生[7]。近来有研究证实，RA的发展是在缺氧微环境中进行的，而HIF-1α正是缺氧信号转导机制中一个重要的调控因子。Hollander等[8]通过免疫组化检测证实，HIF-1α在RA滑膜中大量表达，推测其可能与RA关节腔的缺氧和炎症因素相关。在缺氧和炎症等因素刺激下，滑膜组织HIF-1α的表达增加，可启动VEGF的转录，诱导VEGF的表达，从而促进炎性细胞的侵润、血管增生及血管翳的形成[9]。Tang等[10]研究证实，敲除肿瘤内皮细胞的HIF-1α基因后，不仅能抑制VEGF的表达和实体瘤的血管生成，同时与之相关的生长和自愈功能也都消失，提示HIF-1α-VEGF轴可调控血管形成。因此，阻断缺氧HIF-1α-VEGF这一通路以抑制RA的发生和进展，可能成为临床上治疗RA的新思路。

既往研究已证实，O3治疗RA能够获得良好的疗效，但目前对其作用机制的认识尚有限[11-12]。本研究结果显示，RA组大鼠的膝关节肿胀率、血清及关节内HIF-1α和VEGF表达水平明显高于Con组，提示以上细胞因子参与了大鼠全身性和关节局部的病变进展过程。与RA组比较，O3组大鼠血清的以上细胞因子表达水平无明显变化，提示O3关节腔局部注射无全身性治疗作用；但O3组大鼠的膝关节肿胀程度和关节内上述细胞因子的表达水平明显下降，表明O3可通过调控HIF-1α及VEGF的局部表达来抑制RA的进展过程。

综上所述，关节腔注射O3能消除RA大鼠的膝关节肿胀，通过抑制HIF-1α-VEGF信号通路有效降低关节局部相关细胞因子HIF-1α和VEGF的表达水平，从而减轻局部炎性症状，延缓RA进展。本实验的不足之处在于大鼠的关节比较细小，关节的测量及关节液的获取较为困难；与此同时，本研究尚未确定关节腔注射O3的最佳治疗浓度以及治疗时间，以上不足将在进一步的研究中加以完善。