响应面优化马比木喜树碱提取工艺

周玮 杨艳 张凡 高渐飞

摘要：在现已优化出的马比木喜树碱提取工艺基础上，采用同一产地样品，分别以7个浓度梯度（40%～100%）的甲醇、乙醇为提取液，实验筛选出提取率最高的提取液为70%的甲醇;进一步比较了目前马比木喜树碱提取的4几种方法，提取效率值显示浸泡超声热回流提取法最优。在此基础上，利用响应面法对提取工艺进行了进一步优化，获得了最佳提取工艺为：浸泡时间14.80h.超声时间30.70，液料比为60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工艺条件下，喜树碱含量为2.29%，回归得到的模型预测效果较好。将优化工艺用于提取12个产地的马比木喜树碱含量，将其与文献报道的相同区域样品所测得最高含量比较，优化出的工艺测得含量是其他工艺的2.4至10倍，大幅度提高了喜树碱提取率。具有明顯优越性。

关键词：马比木;喜树碱;响应面优化;提取工艺

中图分类号：R975 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2019）18-0163-05

1引言

茶茱萸科植物马比木（Nothapodytes Pittosporoides）系海桐假柴龙树，灌木或小乔木，分布于贵州、湖南、湖北、四川等地。马比木全草人药，是一种重要的药用植物，人药能祛风除湿、理气散寒，主治风寒湿痹、浮肿、疝气、小儿惊风、半身不遂、风湿痹痛、跌打损伤以及浮肿等。马比木植株含有喜树碱，临床上主要用于治疗消化系统恶性肿瘤，为极具价值的抗肿瘤药物资源。且马比木根中喜树碱的含量相对较高，一般都在0.1%～0.6%之间，高于喜树果中喜树碱的含量0.118%～O。190%。马比木含有喜树碱的发现，以及较低原料成本和较高的含量，使其成为提取喜树碱的重要原料，一定程度上缓解了对喜树资源的依赖。但马比木对生长环境要求更为严格，生长缓慢，产量有限，且目前药用部位为根，必须对树木进行砍伐后采挖，极其不可持续。据报道中国湘西地区2008～2012年对外出售的马比木根达1000t，无序的采挖导致该地区资源日欲濒危;此时段贵州东北部（铜仁万山区、松桃县、印江县等）马比木种植资源也遭受毁灭性采挖，资源安全已受到严重威胁。目前，在无规模化栽植，以及没弄清人工栽植条件下喜树碱含量的状况下，提高资源利用效率将是十分重要的途径，这就需要落实到喜树碱提取工艺优化上来。

国内对马比木中喜树碱提取分离和含量测定的研究已有报道。提取方法可总结如下：①浸泡，超声提取;②浸泡，热回流提取;③直接热回流提取;④室温浸泡提取提取;⑤碱法提取;⑥酸法提取;提取溶剂为甲醇、乙醇，还有酸、碱、树脂等。郑涓等以重庆黔江的马比木根为样品，甲醇为溶剂，采用浸泡，热回流提取;通过单因素及正交试验，确定最优提取工艺为提取溶剂70%的甲醇，温度为70℃，提取时间1.5h;根中喜树碱的提取率0.16%。白永花等以湖南省凤凰县为样品，同时采用乙醇（80%）热回流提取法、乙醇（80%）室温浸泡提取法、甲醇（95%）热回流提取法、碱法提取、酸法提取，得出用80%乙醇溶液室温浸泡提取3次，每次24 h，前12h每隔1小时超声1次（功率260w，频率40 kHz，每次5min）提取率最高，为0.944%。但上述结果，由于样品产地及取样时间不同[马比木不同产地及季节喜树碱含量不同，且用的提取方法和使用的提取溶剂、浓度不同，其结果间可比性差，难以判定究竟哪种提取工艺更有优越性。此外，当前提取工艺的研究中，浸泡、超声等都有利于喜树碱的细胞穿透、浸出，但没有一个优化的条件。为此，本文采用同一样品，用7个浓度级（40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）的甲醇、乙醇作为提取溶剂、采取文献报道过的提取方法（工艺条件）进行提取效率比较，确定最佳提取溶剂、浓度以及提取工艺。在此基础上，进一步探究料液比、浸泡和超声时间对提取喜树碱的效果的影响，通过响应面探寻马比木中喜树碱提取更有效的工艺和技术，为提升马比木资源利用效率及获得更大经济收益提供科技支撑。

2材料与方法

2.1仪器与材料

Agilent分析型高效液相色谱仪;BS210S型电子天平;XFB-500高速中药粉碎机;DK-98-11型水浴锅;喜树碱（对照品），纯度为98%以上;提取时所用甲醇、乙醇、分析纯，HPLC所用甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

马比木测试样品分别于2016年12月，2017年1月、2月、3采自贵州省松桃县、万山区、江口县、播洲区、麻江县，湖南省吉首市、古丈县、凤凰县、永顺县、保靖县，其GPS坐标见表5。其中贵州省5个产地样品由贵州省山地资源研究所采集鉴定;湖南省7个产地样品由吉首大学医学院吕江明教授采集鉴定。工艺优化样品来源12个样品之一（样品11，来源湖南省凤凰县吉信镇万溶江村）。

2.2提取方法

将采集来的马比木根晾干，粉碎过60目筛，备用。在郑涓等口优化出的提取工艺基础上，用不同浓度梯度的甲醇和乙醇进行喜树碱的提取，确定最佳浓度的提取溶剂，然后采用以下4种方法，对马比木根中喜树碱进行提取。

2.2.1溶剂的选择（浸泡超声提取法）

将粉碎好的样品统一称取1g，按照料液比1：60加入不同浓度的甲醇和乙醇，浓度分别为90%、80%、70%、60%、50%、40%。室温浸泡12h，超声30min，补重，过滤，利用HPLC测定溶液中喜树碱的峰面积。

2.2.2方法1（浸泡超声提取法）

将粉碎好的样品1g，加入2.2.1节优化的溶剂及浓度，室温浸泡12h，超声30min，补重，过滤，利用HPLC测定溶液中喜树碱的峰面积。

2.2.3方法2（热回流提取法）

将粉碎好的样品1g，加入2.2.1节优化的溶剂及浓度，在70℃水浴中回流1.5h，补重，过滤，利用HPLC测定溶液中喜树碱的峰面积。

2.2.4方法3（浸泡热回流提取法）

将粉碎好的样品1g，加入2.2.1节优化的溶剂及浓度，室温浸泡12h，在70℃水浴中回流1.5h，补重，过滤，利用HPLC测定溶液中喜树碱的峰面积。

2.2.5方法4（浸泡超声热回流提取法）

将粉碎好的样品1g，加入2.2.1节优化的溶剂及浓度，室温浸泡12h，超声30min，在70℃水浴中回流1.5 h，补重，过滤，利用HPLC测定溶液中喜树碱的峰面积。

2.2.6正交试验

在已确定出的溶剂及提取方法基础上，增加浸泡时间、超声时间、液料比3个影响因子，按照正交试验进行3因素5水平优化实验。

2.3对照品制备

取喜树碱的对照品适量，精密称定，加色谱甲醇制成浓度为0.6mg·mL^-1的对照品储备液，避光保存，备用。利用HPLC测定喜树碱对照品的峰面积，进样量分别为：25、30、35、40、45、50uL。

2.4色譜条件

色谱柱：Waters Symmetry C 18（4.6mm×250 mm，5um）;流动相：甲醇一水（55l 45）;流速：1.0mL·min^-1;检测波长：254nm：柱温：26℃;进样量：40uL。该色谱条件下喜树碱对照品的色谱图见图1。

3结果与分析

3.1提取溶液及浓度

由表1结果可见，在相同的条件下，甲醇和乙醇提取喜树碱面积存在差异性，甲醇提取率优于乙醇。

不同甲醇和乙醇提取效率特征表现为：甲醇浓度为40%～70%时喜树碱的峰面积随着溶剂浓度的提高而增加，溶剂浓度达到70%时峰面积最高，随后峰面积随着溶剂浓度的增加而降低;乙醇浓度为30%～60%时喜树碱的提取率逐步增加，之后乙醇浓度的增高的提取率降低。可见70%的甲醇更有利力喜树碱在溶剂中的扩散，过高过低的溶剂浓度都不利于穿透细胞膜。

3.2不同提取方法提取效率

表2实验结果基础上，各称取1g粉碎好的样品，分别在浸泡超声提取法、热回流提取法、浸泡热回流提取法、浸泡超声热回流提取法4种提取方法下同等条件下检测喜树碱的HPLC峰面积。从表1可以看到，浸泡超声热回流法提取的喜树碱含量最高。浸泡对有效成分的细胞穿透力有影响，超声对有效物质的扩散有影响，且热回流能够加速有机物质的溶出速率，对其提取影响较大，几个方面的优势使得方法4提取的有效物质的峰面积最高。

3.3响应面优化提取工艺条件

模型的建立与方差分析在上述2个实验基础上，增加浸泡时间、超声时间、液料比3个影响因子，设计3因素5水平设计正交试验（表2），根据Box-benhnken软件设计正交实验方案，其结果及方差分析见表3、表4。

对表3实验数据进行回归分析，得到以喜树碱峰面积y关于各因素的回归方程为：

y=0.001627+11938.93A+6383.70B-429.87C+1972.60AB+4977.75AC+1333.0OBC-31400.62A³-2381.8882-7558.53C³。

由表4方差分析可知，喜树碱含量峰值面积回归极显著，且失拟项不显著，说明此回归模型是理想的，可以用用模拟提取时间（A）、料液比的（B）和超声时间的（C）的变化的对喜树碱峰值面积的影响。3个因素中提取时间（A）对峰值面积的影响均达到了显著水平;影响力大小顺次依次为提取的影响>料液比的影响>超声时间。相互项A2对结果具有显著影响，而其他影响不显著。各因素对喜树碱峰值面积的影响是一个复杂的过程，并非简单的线性关系，存在交互作用。

由图3可以看出，3个因素与峰值面积Y呈抛物线关系，即随着各因素值的增加，峰值面积先增加后减少。

工艺条件的确定及验证试验为进一步确定马比木喜树碱提取工艺的最佳参数，采用根据Design-Expert8.0.6软件在模型试验水平范围内进行优化，得到最佳工艺参数为喜树碱提取浸泡时间：14.76h，超声时间：30.73，液料比为60.54，喜树碱峰值面积7342.47。根据实际试验条件，将工艺参数修正为喜树碱提取浸泡时间：14.80h，超声时间：30.70，液料比为60.00。在此工艺条件下，实测马比木根中喜树碱峰值面积为7299.00，与预测值的相对误差为0.6%。

3.4不同产地马比木根中喜树碱含量

在上述修正工艺条件下，测试了贵州万山区、松桃县、湖南吉首市等12个产地马比木根中喜树碱含量。从表5可看出，12个产地马比木喜树碱含量在0.10%～3.89%之间，相互间差异较大;其中湖南省保靖县夯沙乡含量最高、贵州省麻江县坝芒乡最低。在优化工艺条件下，除贵州麻江县坝芒乡外，其余产地含量都在1.50%以上;其中湖南省7个产地喜树碱含量均≥2.29%，平均含量达到2.86%，远高于贵州省5个产地平均含量（1.89%）。

与当前文献采用的工艺所得含量相互比较，本文优化出的工艺测得凤凰县马比木喜树碱含量2.29%，远高于白永花等（2014）优化工艺下0.944%的含量，以及吕江明等0.53%的含量，古丈县含量3.17%，也远高于吕江明等（2010）0.49%的测得含量;永顺县含量2.84%，是吕江明等测得含量（0.31%）的9倍;吉首市三个产地样品喜树碱平均含量2.61%，也是其他工艺测得吉首马比木最高喜树碱含量（0.48%）的5倍;贵州铜仁市3个产地平均含量2.19%，亦是该地区其他工艺最高喜树碱含量的12倍。

4结论与讨论

在已优化出的马比木喜树碱提取工艺基础上，采用同一产地样品，以甲醇、乙醇为提取液，通过实验筛选出提取率最高的提取液及浓度为70%甲醇，并进一步比较了目前提取马比木喜树碱常见的几种方法，确定最佳提取方法为浸泡超声热回流提取法。在此基础上，通过Box-benhnken实验设计建立浸泡时间、超声时间、液料比与提取效率的回归数字模型;通过分析可知3个因素对提取效率影响大小顺序为：提取的影响>料液比的影响>超声时间，且彼此间有较强的交互作用;最终确定最佳提取工艺为：提取浸泡时间：14.80h，超声时间：30.70，液料比为60.00，70℃水浴中回流1.5h。在此工艺条件下，喜树碱峰值面积为7299.00，与预测值的相对误差为0.6%。

通过12个产地的马比木喜树碱含量测定及其与文献报道的相同区域样品所测得最高含量比较，本文优化出的工艺测得含量是其他工艺的2.4～10倍，大幅度提高了喜树碱提取率，具有明显优越性。利用此工艺条件提取马比木中喜树碱，可大幅度提升资源利用效率，以及产生更好的经济效益。

12个产地马比木生长位置的经纬度高底、海拔高度与含量关系并没有呈现一致性特征，但喜树碱含量最低的点海拔最高（样品5），含量最高的点海拔最低（样品12）。考虑到环境要素、测试样品树龄及长势等综合因素影响，是否低海拔地区栽植更有利于马比木喜树碱的产生，获得更高的含量，有待进步一证实，旨为人工栽植环境选择提供支撑。