PD-L1分子的表达与卵巢浆液性腺癌患者发病风险及临床预后关系的研究

刘霞 蔡云朗

1.东南大学，江苏南京 210000；2.泰州市人民医院妇产科，江苏泰州 225300；3.东南大学附属中大医院，江苏南京 210009

卵巢浆液性腺癌(HGSOC)是上皮性卵巢癌(EOC)的主要组织学亚型。其是一个预后差的肿瘤，5年生存率约40%，这是由于诊断时已是晚期以及产生对化疗的耐药性[1]。近年来，研究[2]报道，肿瘤组织的微环境中具有大量肿瘤相关巨噬细胞（TAM），其在介导肿瘤的侵袭、转移和免疫逃逸方面具有重要作用。同时，TAM在细胞表型上与巨噬细胞 （M2）相似且高表达CD68分子，因此CD68分子的表达对判断肿瘤患者发病风险和预后具有一定指导作用。程序性死亡1(PD-1)通路已经成为肿瘤中的强大免疫调节机制。通过对其研究可以更加清楚地了解它的生理调节作用、预后意义和治疗潜力。最近几项研究显示，由于PD-L1在肿瘤细胞上的表达与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的相互作用在肿瘤微环境中对患者预后有显著影响[3]。因此，该研究2010年1月—2017年6月期间选择49例经手术切除的原发性HGSOC标本，并进行临床病理特征、预后及预测相关性方面研究。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集于泰州市人民医院妇科就诊的卵巢浆液性腺癌患者49例，卵巢良性疾病患者8例。依据病史、体格检查、影像学检查、术中所见及术后病理结果确定诊断。卵巢浆液性腺癌患者年龄平均为51.8岁，中位年龄50岁。8例卵巢良性患者年龄平均为41岁，中位年龄42岁。所有病例术前均未接受放疗、化疗和激素治疗。

1.2 免疫组织化学法

采用免疫组织化学法检测卵巢癌和良性组织中PD-L1、CD68分子的表达水平。所有手术切除标本经4%福尔马林固定，石蜡包埋，3～4 μm连续切片。方法如下：石蜡切片，65℃烤片1 h，脱蜡，柠檬酸组织修复液高压热修复2 min，PBS冲洗 5 min 3次；3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min 2次。5%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10 min，倾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1 h。PBS冲洗，5 min 3次。滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30min。PBS冲洗，5 min 3次。滴加适量DAB显色剂，镜下观察，显色3～10 min，即用自来水冲洗终止显色，脱水，透明，封片。

1.3 实验结果判定

应用日本奥林巴斯电子显微镜进行图像采集。目的细胞出现棕黄色或是黄褐色颗粒为阳性染色，PDL1染色判断：显微镜下观察每个样本，随机选择5～6个高倍视野。从每个样本的染色强度和染色阳性的肿瘤细胞比例进行评估。染色强度分为：0（阴性），1（弱阳性），2（中等阳性），3（强阳性），共 4 个级别，最终评级标准：0（阴性），+（1～2），++（3～4）和+++（5～7）。统计学分析时，0不表达，+低表达，++中表达，+++高表达。CD68染色结果判断，方法同上。

1.4 随访

对所有患者进行随机回访，随访0.2～8年，随访时间中位数是4年，截止时间为2018年6月。评价复发的指标为无疾病进展生存时间（PFS），即手术切除病灶后复查时出现卵巢癌肿瘤标记物 CA125升高、影像学检查异常、腹水等复发指征；评价生存预后的指标为总生存时间（OS），即从手术切除病灶后至死亡的时间。如患者未及时复诊则予以书信、电话通知。

1.5 统计方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，PDL1分子和CD68分子与临床病理参数的相关关系使用Chi-square检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD68分子在卵巢癌和良性组织中的表达情况

CD68在良性组织中表达如图1，CD68分子几乎不表达；CD68分子在肿瘤组织中表达，其中低表达16例、中表达和高表达33例。

选取3张CD68分子在肿瘤细胞上表达的图片如图 2、3、4，分别是：低表达、中表达和高表达。

图1 阴性

图2 低阳性

图3 中阳性

图4 强阳性

2.2 PD-L1分子在卵巢癌和良性组织中的表达情况

PD-L1分子在良性组织中表达如图5，PD-L1分子不表达；PD-L1分子在肿瘤组织中表达，其中阴性表达及低表达35例、中表达和高表达14例。选取两张PD-L1分子在肿瘤细胞上表达的图片如图6、7，分别是：低表达和中表达。

图5 阴性

图6 弱阳性

图7 中阳性

2.3 PD-L1分子与肿瘤患者预后生存年数的关系

PD-L1分子表达与肿瘤患者预后生存年数呈负相关（P＜0.05），如图 8。

图8 PD-L1分子与患者生存年数之间的关系

3 讨论

卵巢恶性肿瘤又称卵巢癌，是女性生殖器官常见的肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位。但因卵巢癌致死率高，却占各类妇科肿瘤的首位，对妇女生命造成严重威胁。近些年流行病学统计显示其发病率及死亡率均呈上升和年轻化趋势[4]。尽管手术及化疗等治疗手段不断改进，但5年生存率仅从37%上升至46%，虽然早期卵巢癌患者的生存率会大大得到提升，然而做到早期发现和早期诊断却难以实现，其原因主要包括：疾病的发生、发展机制及病因尚不清楚；缺乏特异性的肿瘤标记物；相关免疫学和分子生物学机制研究尚未完善等[5-6]。近年来，由于医学的发展和研究的深入，人们对卵巢癌的发生、发展过程有了全新的认识。大量的研究[7]表明，机体的免疫调节在卵巢癌的发生、发展过程中起着重要的作用。包括免疫细胞的凋亡、免疫活性物质的分泌异常、炎症因子的分泌异常、免疫细胞的功能失调等，从而诱发卵巢癌的进一步的发展[8]。

PD-L1分子和CD68分子作为免疫细胞表达分子在肿瘤的发生与发展过程中起着重要作用。PDL1是大小为40kD的跨膜蛋白，其在转录和翻译水平的表达均可被调控。在转录水平，细胞信号中的PI3K因子和STAT3转录因子的活化均对PD-L1分子的转录起着关键作用。NF-κB是PD-L1启动子中的重要元件，因此通过作用NF-κB可以起到抑制PD-L1表达的作用。在翻译水平，PTEN基因的改变导致下游相关基因发生变化进而改变PD-L1分子的翻译。 该研究结果显示，CD68分子和PD-L1分子在卵巢癌组织中的表达率和表达强度明显强于卵巢良性组织，因此，说明了卵巢癌中肿瘤相关巨噬细胞的高表达以及PD-L1分子的表达在卵巢癌的发生和发展中承担着重要的作用。同时，该研究发现PD-L1分子的表达与卵巢癌患者预后生存年数呈负相关，因此，说明了PD-L1分子的表达在卵巢癌预后及生存方面起着重要的作用。目前已有文献报道了CD68和PD-L1等相关分子在肿瘤的发生、发展中起到重要作用，但是相关具体的分子机制尚未清楚，因此，针对CD68和PD-L1分子的作用还需要更深入的研究。

综上所述，根据PD-L1分子在卵巢癌中的表达及预后生存的关系，提示该分子的表达可以作为判断卵巢浆液性腺癌患者发病风险及临床预后的重要指标。