RPL34基因在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系

刘 慧，张彬彬，王昊楠，曹 斐，吴晓霞，单永锋，郁 皓

(无锡市第五人民医院肿瘤科，江苏 无锡 214000)

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均位居前列[1-2]。全球每年新发胃癌约100万例，我国占42%～48%[3-5]。目前，手术治疗是可能治愈胃癌的主要手段，然而大部分胃癌患者确诊时已为进展期[6]。进展期胃癌发展迅速、预后极差，治疗选择非常有限，传统化疗初治有效[7]，但治疗时间窗有限，大部分患者在治疗过程中很快相继发生耐药、复发及转移，中位生存期一般不超过12个月[8-10]。

治疗后耐药、复发及侵袭转移等是恶性肿瘤相关死亡的主要原因。随着靶向治疗的迅速发展，肿瘤的精准治疗技术不断提高，合理个体化方案的制定是未来肿瘤治疗的主要发展方向。近年来，恶性肿瘤的靶向治疗以及传统化疗药物基础上的联合靶向治疗逐渐成为研究热点。针对不同患者群体设计个体化治疗方案以及实现进展期胃癌的精准治疗是提高患者生存质量、延长生存期的关键。随着胃癌发生、发展和转移过程中分子生物学和分子病理学等机制的深入研究，有关安全、有效、新型靶向药物的研发逐渐增多，胃癌分子靶向治疗的应用前景广阔。目前，胃癌的靶向治疗策略主要包括抗人表皮生长因子受体2治疗[11]、抗雷帕霉素靶蛋白治疗[12]、抗程序化细胞死亡受体-1[13]、表皮生长因子受体抑制剂和血管内皮生长因子受体抑制剂[14]等。近年来，注射用曲妥珠单抗(赫赛汀)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、曲妥珠单抗美坦新衍生物、阿帕替尼、依维莫司等药物相继应用于临床，但大部分进展期胃癌患者的中位生存期仍未超过16个月[15]。因此，仍需进一步探索新的进展期胃癌治疗手段。

核糖体蛋白L34(ribosomal proteins L34，RPL34)属于RPL34E家族，具有合成蛋白质的功能。早期研究发现，RPL34在多种肿瘤细胞中高表达，在某些恶性肿瘤的发生、增殖、生长、侵袭与转移过程中发挥重要作用[16-17]。研究发现，RPL34在胃癌细胞系中呈高表达，但RPL34在胃癌组织中的表达和分子作用机制及其对胃癌的影响尚不明确[18]。本研究主要探讨RPL34基因在胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年2月至2019年2月在无锡市第五人民医院治疗的60例胃癌患者的胃癌组织标本、配对癌旁组织(距肿瘤边缘≥3 cm)及正常胃黏膜组织，将术后离体标本分为两份，一份于液氮速冻，并转入-80 ℃冰箱冻存；另一份于中性甲醛固定后制成石蜡标本，所有标本均经病理学证实。60例胃癌患者中，男39例，女21例，年龄29～81岁，中位年龄55岁；其中高分化型胃癌10例，中分化型胃癌23例，低分化型胃癌27例； 淋巴结转移：N05例，N115例，N222例，N318例；TNM分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期21例，Ⅲ期31例。所选患者术前均未行放疗、化疗及免疫治疗。

1.2试剂来源 人胃癌细胞株SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45均购自中科院上海细胞研究所，RPMI1640培养基和胰酶蛋白(美国Gibco公司，批号：A11-102)，反转录试剂盒(大连Takara公司，批号：M1705)、提取总RNA所用的Trizol、TaqDNA聚合酶、引物设计合成(美国Invitrogen公司，批号：15596-026)。RPL34基因兔抗人多克隆抗体(购自美国Cell Signaling Technology 公司，批号：A0209)，免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，Western blot试剂盒购自上海吉凯基因公司(英国Amersham公司，批号：A0217)，双抗(一抗鼠抗，二抗羊抗鼠)购自上海新先锋药业有限公司。

1.3细胞培养 将人胃癌SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45细胞株置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，加入含有乙二胺四乙酸的胰酶溶液，按1∶3传代，在5%二氧化碳的37 ℃恒温培养箱中培养。

1.4实时聚合酶链反应法检测不同胃癌细胞株中RPL34基因mRNA的表达 根据美国Invitrogen公司的Trizol操作抽提各组细胞株的总mRNA，按反转录试剂盒说明书进行操作获取互补DNA，将得到的反转录产物进行聚合酶链反应扩增，设定程序为两步法：经95 ℃ 15 s预变性后，再行95 ℃ 5 s变性以及60 ℃ 30 s的延火退伸，共循环45次。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参，以循环阈值(cycle thre-shold，Ct)值反映基因含量，通过2-ΔΔCt方法计算不同组胃癌细胞株中RPL34基因的表达情况。

1.5免疫组织化学染色及结果判定 胃癌组织、配对癌旁组织和正常胃黏膜组织蜡块切片(4 μm)常规脱蜡水化，采用链菌霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶染色法，严格按照试剂盒说明步骤操作，将一抗原液按1∶100稀释，抗体设阳性和阴性对照，光镜下观察免疫组织化学染色切片的显色反应，计数500个细胞中的阳性细胞数，阳性细胞未着色记0分、浅黄色记1分、棕黄色记2分、棕褐色记3分；阳性细胞面积<5%记0分、6%～25%记1分、26%～50%记2分、51%～75%记4分、>76%记4分；根据以上两项分值的乘积得出该切片的最终得分，0～3分为阴性(-)，>3分为阳性(+)。

1.6Western blot法检测RPL34基因表达水平 采用Western blot法检测胃癌组织和正常胃黏膜组织中RPL34蛋白的表达情况。参照试剂盒说明书进行总蛋白抽提和蛋白浓度测定，从不同样品中取出等量蛋白，分别将样品蛋白浓度调为2 g/L，将蛋白上样加入相等体积缓冲液中混匀，沸水煮浴5 min，随后制胶进行电泳，电泳分离后转膜，在4 ℃、300 mA恒流条件下转膜2 h，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，然后进行免疫显色，用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温下封闭2 h，分别加入稀释的一抗RPL34(1∶1 000)和GAPDH(1∶3 000)孵育2 h，TBST缓冲液洗膜3次，用封闭液稀释相应的二抗，在室温下进行二抗羊抗鼠IgG孵育聚偏氟乙烯膜2 h，采用试剂盒进行显色，在暗房中获得显示条带的胶片。

2 结 果

2.1不同胃癌细胞株中RPL34 mRNA的表达水平 通过2-ΔΔCt计算方法得出SGC-7901、MGC80-3、BGC-823和MKN-45细胞株中RPL34蛋白的相对表达水平分别为1.000±0.033、1.332±0.112、0.662±0.042和1.308±0.062，不同胃癌细胞株中RPL34 mRNA的相对表达率比较差异有统计学意义(F=61.477，P<0.001)，其中MGC80-3胃癌细胞株中RPL34 mRNA的表达最高。

2.2RPL34基因在胃癌组织中的表达情况 免疫组织化学分析显示，RPL34在胃癌组织、配对癌旁组织及正常胃黏膜组织中的表达率分别为81.7%(49/60)、38.3%(23/60)和10.0%(6/60)，差异有统计学意义(χ2=63.665，P<0.001)。

2.3胃癌组织和正常胃黏膜组织中RPL34蛋白的表达情况 正常胃黏膜组织与胃癌组织中RPL34蛋白的表达存在差异，见图1。胃癌组织中RPL34蛋白的表达水平为0.634±0.003，正常胃黏膜组织为0.166±0.001，差异有统计学意义(t=44.083，P<0.001)。

RPL34：核糖体蛋白L34；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

2.4RPL34基因表达与胃癌患者临床病理特征的关系 不同性别、年龄、肿块大小的RPL34基因阳性表达率比较差异无统计学意义(P>0.05)，不同肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期的RPL34基因阳性表达率比较差异有统计学意义(均P<0.01)，病理分化程度越差、合并淋巴结转移且TNM分期越晚的胃癌患者RPL34基因阳性表达率越高，见表1。

表1 RPL34表达与胃癌患者临床病理特征的关系 (例)

RPL34：核糖体蛋白L34

3 讨 论

核糖体旧称“核糖核蛋白体”或“核蛋白体”，被认为是细胞的细胞器之一，除哺乳动物的成熟红细胞以及植物筛管细胞外，普遍存在于其他细胞中。一般原核细胞只有一种核糖体，而真核细胞有两种核糖体。核糖体是一种细胞内的核糖核蛋白颗粒，是蛋白质合成的重要细胞器，在快速增殖、分泌旺盛的细胞中较多，其成分由RNA和蛋白质构成，主要功能是将mRNA上的核苷酸顺序按指令翻译成蛋白质多肽链上的氨基酸顺序，故被称为肽链的装配机，即细胞内蛋白质的分子机器。核糖体蛋白是构成核糖体的蛋白质，在真核生物细胞中已发现80种核糖体蛋白，广泛分布于各组织[19-20]。研究表明，核糖体蛋白不仅具有合成蛋白质的功能[21]，还可能参与调控基因转录和翻译、DNA修复、细胞增殖，并可维持细胞形态等核糖体以外的功能[22-23]。近年来，在胃癌、结直肠癌、胰腺癌等消化道肿瘤组织中也发现RPL34基因表达，其对肿瘤细胞的增殖、侵袭以及血管生成起促进作用，可能在肿瘤的发生、发展及预后中发挥重要作用。对肿瘤组织核糖体蛋白的深入研究，进一步阐明了肿瘤发生、发展的机制。

目前，国内外对RPL34基因与胃癌生物学特点及其临床预后关系的研究较少，本研究通过实时聚合酶链反应法测定不同胃癌细胞株中RPL34基因表达情况的研究显示，RPL34在不同胃癌细胞株中均有表达，在MGC80-3细胞株中呈高表达。体外实验证实，RPL34在胃癌细胞系中呈高表达[16]。采用免疫组织化学法检测胃癌组织、配对癌旁组织和正常胃黏膜组织中RPL34基因的表达显示，胃癌组织中RPL34基因的表达明显高于正常胃黏膜组织。采用Western blot法进行检测进一步验证了上述结果，提示胃癌组织中RPL34蛋白表达高于正常胃黏膜组织。本研究结果显示，不同肿瘤分化程度、淋巴结转移、TNM分期的RPL34基因阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示RPL34蛋白高表达可能是影响胃癌患者预后的危险因素，可能参与胃癌的发生、发展、侵袭及转移过程。

综上所述，胃癌组织中RPL34基因的高表达可能与胃癌的发生发展密切相关。RPL34 mRNA的表达水平可能成为胃癌患者随访及预后评估的重要指标，并可能为制定精准胃癌靶向治疗策略提供新的线索。核糖体蛋白具有结构复杂、种类繁多、功能多样等特点，目前对RPL34基因及其与肿瘤生物学特性关系的研究较少，未来对RPL34基因的深入研究将为认识肿瘤的临床病例特征以及肿瘤治疗提供帮助。