长枝木霉TL16菌株对南方根结线虫的防治效果

李 瑞，李惠霞，谢丙炎，卢智琴，罗 宁

(1.甘肃农业大学 植物保护学院/甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院 蔬菜花卉研究所，农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081)

根结线虫(Meloidogyne)是一类植物寄生性线虫，具有种类多、分布广、致病性强、繁殖及传播速度快的特性，其寄主范围超过5 500种，已成为设施农业生产中连作障碍及致病成灾的重要病原线虫之一[1-2]。迄今，已发现的根结线虫约有100多种，其中爪哇根结线虫(M.javanica)、花生根结线虫(M.arenaria)、南方根结线虫(M.incognita)和北方根结线虫(M.hapla)是主要的世界性害虫，以南方根结线虫(M.incognita)危害最为严重[3]。随着设施蔬菜的迅速发展，长期连茬栽培，使得根结线虫病的危害日益严重。据联合国粮农组织(FAO)估计，全世界每年由于植物寄生线虫病害造成的经济损失达100亿美元[7-9]，在我国每年因根结线虫危害造成的损失达4亿美元[10]。

根结线虫二龄幼虫孵化后，受根系分泌物的吸引，寻找寄主植物。二龄幼虫可侵染根部的所有部位，进入根组织后形成稳定的取食位点，诱导植物根系形成巨型细胞[4]，严重影响植物对水分和养分等物质的吸收和利用[5]。同时，根结线虫侵入造成的伤口有利于土壤中其他病原物的侵入，引起复合侵染，进一步加重危害[6]。根结线虫病的防治方法主要包括化学防治、农业防治、抗病品种的利用及生物防治等。化学杀线剂具有毒性高、降解慢，对环境污染严重等缺点。培育抗病品种是防治根结线虫病最经济有效的措施，但因致病性分化及抗病种质资源的缺乏，限制了抗病育种的进程[11]。生物防治因其具有清洁、高效的优势，可满足无公害蔬菜的生产要求，是目前国内外线虫防治的重点和热点之一。越来越多的木霉(Trichoderma)菌株被开发成生防制剂广泛用于蔬菜根结线虫病的防治。木霉是一类分布广泛的土壤习居菌，大量存在于植物根际及根表，是防治植物寄生性线虫的重要生防资源[12]。木霉菌可以寄生于根结线虫的卵，其发酵液可以杀死根结线虫二龄幼虫，减少根结数量。哈茨木霉菌TRI2在田间对黄瓜根结线虫的防治效果达到72.20%，与阿维菌素具有相似的防治效果[17]。文献报道[13-16]，长枝木霉菌(T.longibrachiatum)的多个菌株如T6，T05和T115D对根结线虫具有较高的防治效果。张树武等[16,18]研究报道，长技木霉菌株T6分生孢子悬浮液对黄瓜根结的抑制率为33.00%～79.00%。

受环境因素的影响，同一菌株在不同地区对线虫的防治效果并不稳定，且不同的菌株对不同线虫的寄生能力也不相同，因而每个菌株的应用范围受到了限制。为应对不同地区、不同线虫危害的问题，进一步挖掘防治根结线虫的木霉菌资源。试验利用长枝木霉菌株TL16孢子悬浮液测定对南方根结线虫卵和二龄幼虫寄生和抑制效果，通过盆栽试验测定TL16对黄瓜根结线虫病的防治效果，以期为新型、高效的木霉菌杀线剂的开发及应用奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试长枝木霉TL16菌株(Trichodermalongibrachiatum)，由甘肃农业大学植物保护学院植物线虫学实验室分离，鉴定并保存。

南方根结线虫(Meloidogyneincognita)由中国农业科学院蔬菜花卉研究所病害组实验室分离鉴定，在茄门辣椒上扩繁。

供试黄瓜(Cucumissativus)品种为中农6号，购自中蔬种业科技(北京)有限公司。

1.2 制备方法

1.2.1 长枝木霉TL16孢子悬浮液制备 将TL16在PDA平板上25℃培养7 d，向培养物中加一滴Tween-80和5 mL无菌水，反复冲洗，使分生孢子脱落，即得到分生孢子悬浮液原液。用血球计数板计算孢子浓度(3×107cfu/mL)，然后分别稀释为1.5×107、7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mL，备用。

1.2.2 根结线虫卵悬浮液制备 待茄门辣椒上的根结线虫成熟后，用自来水清洗辣椒根部，挑取新鲜卵块，置于含1.0% NaClO的5 mL离心管中，涡旋震荡。在超净工作台内，用灭菌的100目(孔径147 μm)网筛过滤，收集滤液，然后用400目(孔径38 μm)网筛过滤，最后用无菌水将400目网筛上的卵冲洗至2 mL离心管中离心，制成1 000个卵/mL的悬浮液[19]。

1.2.3 根结线虫二龄幼虫收集 从辣椒根上挑取成熟卵块用0.5%的NaClO消毒3～5 min，再用无菌水漂洗干净，将卵块置于滤网上，在直径90 mm培养皿中加蒸馏水，于28℃孵化，24 h后从筛网下收集孵化的二龄幼虫，制成1 000条/mL的线虫悬浮液备用。

1.2.4 长枝木霉TL16孢子悬浮液对根结线虫卵及二龄幼虫的作用 该试验在灭菌的96孔细胞培养板，25℃进行，每个孔中加50 μL线虫(50 μL卵)悬浮液，100 μL TL16孢子悬浮液(7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mL)，以100 μL无菌水为对照，处理和对照均重复12次，共2次生物学重复。分别在24，48和72 h观察线虫的死亡情况；3，6和9 d观察卵孵化情况，计算二龄幼虫死亡率，卵孵化相对抑制率。

1.2.5 长枝木霉TL16盆栽试验 将黄瓜种子依次用70%酒精和5%的NaClO各消毒3 min和5 min，最后用无菌水洗干净，28℃催芽至露白后播种于育苗盘中，待黄瓜苗两叶期时在处理液中浸根5 min后移栽至体积约300 mL的塑料杯中，每杯含80 g灭菌土壤(基质与蛭石3∶1)，移栽一株。试验设5个处理，分别是浓度为3×107、1.5×107、7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mLTL16孢子悬浮液以无菌水和1.8%的阿维菌素乳剂为对照。每处理18株，重复3次，共2次生物学重复。黄瓜移苗7 d后，在距根部2 cm处打1 cm深的小孔，接南方根结线虫二龄幼虫500条，40 d后观察根部根结线虫病害症状，统计根结数，根据根结数量及大小记载病情级别，并计算根结指数(GI)，评价防治效果。

根结线虫病的分级方法采用Garabedian和Van Gundy(1983)[20]的分级标准，0级：根系健康，无根结；1级：有极少量根结，占全根系的1%～20%；2级：有少量根结，占全根系的21%～40%；3级：根结数量中等，占全根系的41%～60%；4级：根结数量很多，占全根系的61%～80%；5级：根结数量极其多且大，占全根系的81%～100%。

1.3 数据分析

采用Excel和Word 2010进行数据处理和表格绘制，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，利用Duncan新复极差法进行差异显著性检验(α=0.05)。表中数据为平均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 长枝木霉TL16孢子悬浮液抑制线虫卵孵化

长枝木霉TL16孢子悬浮液对根结线虫卵孵化具有明显的抑制作用(表1)。其中，处理3 d时CK和1.5×106、3×106、7.5×106cfu/mL孢子液中卵孵化率分别为8.57%、4.05%、4.29%、4.05%，6 d时分别为13.93%、6.07%、5.36%、5.24%，9 d时分别为21.55%、10.00%、10.83%、6.67%，各处理浓度卵孵化率与对照均存在显著差异。在第9 d时，浓度为7.5×106cfu/mL的孢子悬浮液对根结线虫卵孵化的抑制率显著高于其他2个浓度，抑制率达69.05%。同样在第3、6 d时，7.5×106cfu/mL的浓度对卵孵化抑制率也略高于其他2个浓度，抑制率分别是52.78%和62.39%。试验表明，7.5×106cfu/mL孢子液对根结线虫卵孵化抑制效果最佳。从处理时间分析，在第6 d时，各处理浓度的平均抑制率最高，达到60.11%。

表1 不同浓度TL16孢子悬浮液对南方根结线虫卵孵化的抑制作用

注：数据为平均值±标准误；同列数据后不同小写字母表示菌株间差异显著(P<0.05)，下同

2.2 长枝木霉TL16孢子悬浮液对根结线虫二龄幼虫的致死作用

试验结果表明，长枝木霉TL16孢子悬浮液对南方根结线虫二龄幼虫无致死作用(表2)。在处理后24、48 h，TL16孢子悬浮液对根结线虫的致死作用与对照之间无显著差异，在72 h，TL16与CK之间略有差异，致死率为1.65%。

2.3 长枝木霉TL16对黄瓜根结线虫盆栽防治效果

TL16孢子悬浮液能够显著降低黄瓜根结指数，不同浓度处理间存在显著差异，防治效果随着浓度的增大呈先增后减趋势(表3)。当浓度为7.5×106cfu/mL时，对线虫的防治效果最佳，根结指数为31.78%，防治效果达55.00%，其次是1.5×107cfu/mL，根结指数和防治效果分别为35.33%和50.00%，与阿维菌素的防治效果均无显著差异。试验结果表明，长枝木霉TL16孢子悬浮液对黄瓜根结线虫具有与阿维菌素相似的防治效果，可有效的防治根结线虫(图1)。

表2 TL16孢子悬浮液对南方根结线虫的致死作用

图1 TL16孢子悬浮液对黄瓜根结线虫的防治作用Fig.1 Control effects of TL16 spore suspension on M.incognita cucumberA.对照；B.1.8%阿维菌素；C.7.5×106孢子悬浮处理

3 讨论

根结线虫是农作物的重要病原物之一，近年来随着全球气候变暖和作物复种指数的不断提高，根结线虫对作物的危害愈来愈严重[23]。木霉作为一种重要的生防菌，在防治植物寄生性线虫方面具有巨大的价值和应用前景。试验从孢子悬浮液对南方根结线虫卵和二龄幼虫的离体试验和温室盆栽2个方面测定了长枝木霉菌株TL16对根结线虫的防治效果，发现TL16孢子悬浮液对线虫卵孵化具有较强的抑制作用，但对二龄幼虫没有致死作用。在盆栽试验中，浓度为7.5×106cfu/mL的孢子悬浮液的防治效果较佳，其作用与阿维菌素基本相当。试验结果可为根结线虫生防菌的应用以及木霉生物制剂的开发利用提供依据。

目前有关木霉的生防机理主要表现在抗生、竞争、重寄生和诱导抗性等方面[27]。木霉产生的Peptaibols，可抑制多种病原菌，如11残基，14残基和18残基的Peptaibols可抑制番茄早疫病，水稻纹枯病及辣椒疫霉病等[28]。有研究报道，绿色木霉中含有蔗糖水解反应的胞内转运酶，可以跟病原菌竞争植物分泌的碳水化合物[29]。哈茨木霉可诱导菜豆对灰霉病和炭疽病产生抗性[30]，还可以产生几丁质酶抑制根结线虫卵的孵化[31]。张树武等[22]研究发现长枝木霉分生孢子悬浮液对小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫具有较强的致死和寄生作用。

试验结果表明，长枝木霉TL16孢子悬浮液对根结线虫二龄幼虫无致死作用，这与张树武等[22]研究发现长枝木霉分生孢子悬浮液对小麦禾谷孢囊线虫二龄幼虫具有较强的致死和寄生作用不同，可能是受不同菌株致病性强弱、线虫种类和植物种类及其对气候的适应性等因素的影响[23]，但其孢子悬浮液对根结线虫卵孵化具有明显的抑制作用，这与Windham等[31]研究结果相似。盆栽试验中TL16孢子悬浮液对黄瓜根结线虫表现出较好的防效，防治效果随着孢子浓度增大呈先增后减的趋势。当孢子浓度为7.5×106cfu/mL时防效最佳，可能是TL16的大量繁殖与植株形成竞争关系，从植株和土壤中汲取生长所需营养物质，占据植株的生长空间，使得植株抗性降低。推测TL16除抑制卵孵化外，还可能诱导植株产生抗性，另外，TL16菌株能否对植株起到促生作用，这些都有待进一步的研究。

4 结论

长枝木霉TL16孢子悬浮液对南方根结线虫卵孵化具有较明显的抑制作用，处理9 d，浓度为7.5×106cfu/mL悬浮液抑制率为69.05%。同时在盆栽试验中，TL16孢子悬浮液对黄瓜根结线虫的防治效果随着孢子浓度增大呈先增后减的趋势，浓度为7.5×106cfu/mL时防效最佳，为55.00%。