茶多酚对草鱼肝脏和肠道影响的显微超微观察

(安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036) (安徽省合肥市第一中学，安徽 合肥 230601) (安徽农业大学动物科技学院，安徽 合肥 230036)

我国是茶叶生产大国，茶园种植面积达284.9万公顷[1]，茶树修剪产生的枝叶、茶叶加工产生的茶碎梗叶、大量夏秋茶等都可以用来提取茶多酚[2, 3]。TPs(tea polyphenols)是茶叶中多酚类物质总称，占其干重的20%～30%[4]，适量的TPs可显著促进鱼类的生长，这可能与TPs促进鱼类代谢以及增强消化吸收能力有关[5, 6]。TPs可以降低鱼类肝脏脂肪代谢相关基因的表达，提高鱼类肝脏抗氧化能力[5, 7]；适量的TPs可显著提高青鱼(Mylopharyngodonpiceus)肠道脂肪酶和蛋白酶活力[6]。TPs对动物肝脏与肠道的结构存在某些影响，例如TPs可使营养型肥胖大鼠肝细胞体积增大，减小肝血窦间隙[8]，TPs还能够提高肉鸭回肠绒毛高度，增加回肠绒毛表面积[9]。但目前缺乏TPs对鱼类影响的相关研究。为此，笔者以TPs饲喂草鱼，并对其肝脏和肠道进行显微和超微观察，探讨了TPs对鱼类肝脏和肠道微观结构的影响，以为新型饲料添加剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验鱼购自合肥市大兴镇渔场，购回后采用1%浓度食盐水消毒7～8min，暂养2周。暂养期间，每天饱食投喂对照组饲料2次。TPs购自芜湖天远科技开发有限责任公司，纯度为98.37%。

1.2 试验方法

试验采用室内循环水养殖系统。该系统由单个体积为60cm×60cm×60cm(有效水体180L)的塑料水族箱与过滤池组成。养殖用水为曝气自来水，水温(28±1.0) ℃，日光灯8：00～20：00照明。

前期试验中以0.00%～0.40%范围的TPs投喂草鱼，其中0.05% TPs组转化效率显著高于其他各组，其他各组之间无显著差异，因此取无添加对照组、添加量最高的0.40%组以及生长效果最好的0.05%组进行比较，分别配制3种饲料。基础饲料(对照组)粗蛋白含量为35.7g/100g(蛋白质主要来源为豆粕等植物蛋白)，能值15.13J/mg。饲料为粒径2mm的颗粒饲料，65℃烘干，-20℃冰柜保存。

试验开始前饥饿草鱼24h，每箱随机称取30尾放入，每种处理3个平行。初始平均体重为4.50g。每天上午9：00和下午3：00过量投喂饲料1次，1h后回收残饵。

8周后结束生长试验，饥饿24h后称量各组体重，每组取3尾试验鱼，第一脊椎处剪断处死，取肝脏和前肠。同一样本分2份，1份用作显微切片，另1份用作电镜切片。

1.3 显微切片制作与观察

新鲜肝脏和前肠切小块，投入Bouin氏固定液固定24h，70%酒精溶液浸洗，经梯度酒精脱水，再浸在二甲苯中至透明，用石蜡透蜡和包埋，切片机切片(厚度为6μm)，经展片和烘片后，进行苏木精-伊红染色(HE染色)，中性树胶封片，在光学显微镜下观察并拍照。

1.4 电镜切片制作与观察

新鲜肝脏和前肠切修成小于1mm3的小块，2.5%戊二醛固定2h，0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸固定3h，0.1mol/L磷酸缓冲液漂洗，梯度酒精脱水，Epon 812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，采用日立HT7700型透射电子显微镜观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 TPs对草鱼肝脏结构的影响

3组草鱼的肝脏显微结构如图1所示。可见各组肝细胞细胞核明显，细胞界限明显，但对照组肝血窦间隙最宽(图1(a))，0.05%组肝血窦间隙最窄(图1(b))，0.40%组有宽的肝血窦出现。

注：H为肝细胞；N为细胞核；RC为红细胞；HS为肝血窦图1 TPs对草鱼肝细胞显微结构影响

3组草鱼肝细胞超微结构如图2所示。可见各组肝细胞膜明显，细胞核近似椭球形，线粒体成棒状或球形并贴近细胞核周围的粗面内质网，细胞质中可见数个脂肪滴。但对照组与0.40%组肝细胞胞质中脂肪滴数量多体积大(图2(a)和(c))，细胞核偏离细胞中央位置，贴近细胞膜；0.05%组肝细胞细胞质的脂肪滴体积明显变小(图2(b))，细胞核略偏离中央位置。

2.2 TPs对草鱼肠道结构的影响

3组草鱼肠道黏膜层显微结构如图3所示。可见各组肠黏膜上皮细胞排列整齐，纹状缘发达。与对照组相比，2个TPs组固有膜中血管更为丰富，黏膜层上皮内杯状细胞更多，0.40%组的杯状细胞最多。

注：Sb为纹状缘；Ep为上皮细胞；GC为杯状细胞；Pr为固有膜图3 TPs对草鱼肠道黏膜层显微结构影响

3组草鱼肠道黏膜层上皮吸收细胞游离面超微结构如图4所示。可见各组微绒毛均匀紧密地分布，靠近微绒毛端的细胞质中有线粒体分布。2个TPs组的线粒体数量明显多于对照组，其中0.05%组最多，分布最密集。

注：Mi为线粒体；Mic为微绒毛图4 TPs对草鱼肠道吸收细胞游离面超微结构影响

3 讨论

研究表明，TPs可减轻营养型肥胖大鼠肝脏脂肪变性，缩小肝血窦间隙[8]。研究中，添加TPs可使草鱼肝细胞排列紧密，肝血窦间隙缩小，与上述研究结果相似。但也有研究显示，草鱼肝脏出现损伤时，肝血窦间隙增大[10, 11]，这表明TPs可能对肝脏有一定保护作用。

已有研究显示，适量TPs可降低鱼类肝脏中脂肪相关合成基因的表达，减少肝脏中脂肪沉积[5, 12]。笔者研究则直观地显示0.05% TPs可明显减小肝细胞中脂肪滴体积，明显减少肝细胞中脂肪含量。对犬肝细胞的超微观察显示，TPs也减少了肝细胞中脂肪滴含量[13]。此外，研究中对照组和0.40%组肝细胞的细胞核贴近细胞膜，而0.05%组的细胞核偏移程度较小，这应该与前两组细胞质中脂肪滴数量多体积大有关，营养性脂肪肝细胞的胞质中充满脂肪滴，细胞核就会被脂肪滴挤偏移位[14]。这些研究表明，TPs确实有降低肝脏脂肪含量的作用，但不同剂量效果不同。用TPs饲喂大黄鱼(Larimichthyscrocea)，0.02%的剂量对肝脏的降脂作用最为显著[12]。0.05%组的降脂效果强于0.40%组，可以大体推测，TPs降低肝脏脂肪需要较低的剂量即可。

鱼类肠道黏膜层最上层为上皮层，该层含有吸收细胞和杯状细胞，吸收细胞游离面具有明显的纹状缘(电镜下的微绒毛)，可增加肠表面吸收面积[15]；吸收细胞本身消化功能旺盛，胞质内存在线粒体以提供能量[16]；杯状细胞则主要产生黏蛋白，该蛋白有润滑、保护、免疫防御、消化和吸收等多种功能[17]；同时，黏膜层的固有膜中有毛细血管输送营养物质[15, 18]。TPs对微绒毛高度及密度无明显影响，但明显增加了吸收细胞中线粒体数量以及杯状细胞数量，TPs也使固有膜中的毛细血管变得更为丰富，其中0.05%组表现更为明显，这些都表明TPs能够影响肠道黏膜层的一些形态结构，从而提高肠道的消化吸收能力。