肺结核患者外周血和支气管肺泡灌洗液Vδ2+ T淋巴细胞比例的临床意义▲

曹秀廷 王兆芬

(青海省第四人民医院重症医学科，西宁市 810000，电子邮箱：1907028184@qq.com)

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性疾病，其死亡率居单一病原体感染的疾病之首。近年来，肺结核的发病率呈逐年升高趋势，据世界卫生组织统计报告，我国肺结核的发病率居世界第3位，而且，随着耐药病菌的出现，该疾病已对人类生命安全造成重大威胁[1]。目前，人体抗结核感染相关的免疫机制尚未完全阐明，研究证实αβ T淋巴细胞及巨噬细胞在结核感染中发挥重要作用，γδ T淋巴细胞在结核杆菌感染的免疫调控中亦发挥重要作用[2]。Vδ2+T淋巴细胞作为γδ T淋巴细胞的主要亚群，不仅具有先天免疫细胞的特征，亦具有适应性免疫的特征，可通过分泌不同功能的细胞因子调节机体的免疫应答，但目前有关Vδ2+T淋巴细胞在结核病中相关调控机制的研究相对较少[3]。本研究探讨肺结核患者外周血及支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中Vδ2+T淋巴细胞的比例及血清相关细胞因子的水平，以期为结核病的防治提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年2月至2017年2月在我院就诊的肺结核患者82例作为研究对象。纳入标准：(1)年龄21～65岁；(2)均为新发确诊患者；(3)所有研究对象均知晓本研究目的，签订知情同意书。排除标准：(1)有自身免疫性疾病、心脑血管等严重疾病者；(2)有糖尿病、高血压等并发症者；(3)临床资料不全者。其中活动性肺结核患者37例(活动性肺结核组)，潜伏性肺结核患者45例(潜伏性肺结核组)。活动性肺结核组男性25例，女性12例，年龄21～62(41.23±5.67)岁，体质指数18.25～24.18(22.05±2.13)kg/m2，吸烟或有吸烟史者20例；潜伏性肺结核组男性30例，女性15例，年龄24～65(42.12±6.35)岁，体质指数18.50～24.33(22.25±1.95)kg/m2，吸烟或有吸烟史者28例。另选取同期健康体检者40名作为健康组，其中男性25例，女性15例，年龄22～63(40.95±5.52)岁，体质指数18.33～24.25(21.89±1.88)kg/m2，吸烟或有吸烟史者21例。3组研究对象体质指数、性别、年龄及吸烟情况差异均无统计学意义(均P>0.05)，具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准同意。

1.2 诊断标准 健康组患者无结核病临床症状，相关影像学检查均无结核病征象，结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)结果为阴性。潜伏性肺结核组患者诊断标准：(1)与肺结核人群有密切接触；(2)TST检测阳性；(3)患者无明显临床症状，影像学检查呈阴性。活动性肺结核患者诊断标准：(1)有咳嗽、出血症状；(2)影像学检查显示肺部阴影；(3)TST检测阳性。

1.3 实验方法

1.3.1 标本采集：(1)血清标本采集：采集所有研究对象入院次日清晨或体检当日清晨空腹外周静脉血3 mL，置于枸橼素钠抗凝管中，一部分血标本以3 500 r/min离心后取上清，另一部分标本加入磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)以1 ∶1比例稀释后转入预先装有3 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中，600 r/min离心15 min，弃上清以10 mL PBS重悬后400 r/min离心8 min，采用RPMI 1640(美国Gibco公司，批号：20171204)重悬调整细胞密度为2.5×109个细胞/L。(2)BALF标本收集：采用2%利多卡因对肺结核患者咽部进行雾化麻醉，经咽部插入BF-F260型纤维支气管镜(日本奥林巴斯公司)，进入气管支气管后通过细的硅胶管注入2%利多卡因2 mL对肺部病灶进行局部麻醉，通过硅胶管分3次注入150 mL 37℃无菌生理盐水，采用负压法回吸灌洗液，记录回吸的灌洗液总量，灌洗液回收率超过40%为标本收集成功。BALF经双层纱布过滤并采用生理盐水洗涤两次后，以RPMI 1640重悬调整细胞密度为2.5×109个细胞/L备用。

1.3.2 Vδ2+T淋巴细胞百分率测定：取1.3.1获取的外周血或BALF细胞悬液100 μL，用含1% 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的PBS洗涤两次后，加入Vδ2+T的荧光抗体藻红蛋白抗人T淋巴细胞抗原受体Vδ2+(T cell receptor Vδ2+，TCRVδ2+)(美国BD Bioscience公司，批号：2018020901)和CD3+T的CD3-APC荧光单克隆抗体(美国BD Bioscience公司，批号：2018012603)，于4℃条件下避光孵育30 min，再次以含1% BSA的PBS溶液洗涤两次后加入100 μL 1%的多聚甲醛溶液重悬，于CytomicsTMFC500流式细胞仪(美国Beckman公司)，采用CXP仪器操控软件采集前向和侧向散射光信号，并采用配套软件CXP 2.2对实验数据进行处理分析，以Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞CD3+T淋巴细胞的百分数作为Vδ2+T淋巴细胞的相对水平。

1.3.3 血清相关细胞因子检测：采用双抗夹心酶联免疫法检测血清γ干扰素(interferon,IFN-γ)、白细胞介素(interleukin,IL)4、IL-10水平，仪器为Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，检测试剂盒均购自美国R&D Systems公司(批号分别为CAA31639，P05112，P22301)。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较方差分析,两组间比较采用LSD-t法；计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组研究对象外周血Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞百分比比较 健康组、潜伏性肺结核组、活动性肺结核组患者外周血Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞百分比分别为(8.67±0.56)%、(7.05±0.45)%、(5.54±0.42)%，组间差异有统计学意义(F=408.385，P<0.001)；其中活动性肺结核组和潜伏性肺结核组患者外周血Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞百分比均低于健康组(均P<0.05)。见图1。

图1 3组研究对象外周血Vδ2+ T淋巴细胞流式图(示例)

2.2 活动性肺结核组和潜伏性肺结核组患者BALF中Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞百分比比较 活动性肺结核组BALF中Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞百分比为(1.92±0.21)%，低于潜伏性肺结核组的(3.35±0.30)%(t=24.470，P<0.001)。见图2。

图2 两组患者BALF中Vδ2+ T淋巴细胞流式图(示例)

2.3 3组研究对象血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平比较 潜伏性肺结核组和活动性肺结核组患者血清IFN-γ、IL-4、IL-10水平均高于健康组，活动性肺结核组患者血清IL-4、IL-10水平均高于潜伏性肺结核组(均P<0.05)。见表1。

表1 各组患者外周血IFN-γ、IL-4、IL-10水平比较(x±s，ng/L)

注：与健康组比较，aP<0.05；与潜伏性肺结核比较，bP<0.05。

3 讨 论

γδ T淋巴细胞是于1986年发现的一类特殊T淋巴细胞，约占T淋巴细胞的1%～5%，其表面主要表达由γ和δ链组成的多样性T淋巴细胞受体，具有与αβ T淋巴细胞相似的免疫功能，但又有其独特特点，主要表现为无主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制识别抗原，无须细胞提呈，兼有天然免疫和适应性免疫，具有杀伤和调节的双重功能[4]。γδ T淋巴细胞主要分为Vδ1+T淋巴细胞和Vδ2+T淋巴细胞两个亚群，其中Vδ2+T淋巴细胞是外周血的主要γδ T淋巴细胞亚群，在正常生理状态下占γδ T淋巴细胞的50%～90%。Vδ2+T淋巴细胞能够产生辅助性T淋巴细胞(helper T cell，Th)1、Th2、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)等多种类型的细胞因子，在肿瘤免疫和感染免疫中均发挥不同的免疫作用，同时能够向αβ T淋巴细胞提呈抗原并与刺激信号协同促进αβ T淋巴细胞的增殖分化[5]。

目前，γδ T淋巴细胞的生物学活性及在机体不同疾病中所发挥的作用尚未完全清楚。李元元等[6]研究表明，慢性乙型肝炎病毒感染患者外周血及肝脏内Vδ2+T淋巴细胞亚群的百分比较健康人下降，与肝脏炎症分级、纤维化程度及HBV DNA载量呈负相关，但Vδ1+T淋巴细胞并无明显变化，说明炎症环境对Vδ2+T淋巴细胞具有一定影响，Vδ2+T淋巴细胞数量下降与慢性乙型肝炎病情的发展有一定的关系。Rei等[7]指出，γδ T淋巴细胞能够招募免疫抑制性骨髓T淋巴细胞，抑制抗肿瘤反应，增强血管新生，参与肿瘤进程。马俊等[8]研究表明，肝癌患者外周血中Vδ2+T淋巴细胞所占比例低于健康人，导致其对肿瘤细胞的杀伤作用和免疫清除作用降低可能是导致肝癌发病的原因之一。本研究结果显示，活动性肺结核患者和潜伏性肺结核患者外周血Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比低于健康对照组，且活动性肺结核患者外周血和BALF中Vδ2+T淋巴细胞占总淋巴细胞的百分比低于潜伏性肺结核患者(均P<0.05)，提示Vδ2+T淋巴细胞在结核感染进程可能发挥重要作用，其水平下降可能使机体免疫反应降低，导致机体无法清除病原体。

以往研究表明肺结核患者Th1/Th2比例失衡所致细胞因子发生变化可能是影响结核病进展的机制之一[9]。IFN-γ是调控免疫细胞活化、对结核感染起抵抗作用的Th1型细胞因子；IL-10和IL-4属于多功能的Th2型细胞因子，在结核分枝杆菌的免疫逃逸和潜伏感染中发挥重要作用[10]。Chen等[11]研究表明，在灵长类动物中Vδ2+T淋巴细胞能够识别结核杆菌，在感染早期细胞的增殖分化能够产抗结核杆菌的细胞因子IFN-γ，减缓肺组织病变进程，同时能够产生IL-12，增强CD4/CD8 Th1型细胞的免疫反应，增强机体对结核病的抵抗能力。本研究结果显示，活动期和潜伏期肺结核患者血清IFN-γ、IL-10、IL-4水平均高于健康人，且活动性肺结核患者IL-10、IL-4水平均高于潜伏性肺结核患者(均P<0.05)，与张锡林等[12]研究结果相似。结合本研究结果的潜伏期肺结核患者外周血及BALF中Vδ2+T淋巴细胞的百分比相对高于活动期患者，血清IL-10和IL-4水平低于活动期患者，笔者认为Vδ2+T淋巴细胞在感染初期可以启动机体免疫反应，调控相关细胞因子分泌，进而发挥抗结核杆菌感染的作用；而随着病原菌的不断刺激，Vδ2+T淋巴细胞过度活化，FasL诱导凋亡，其调控相关细胞因子分泌的作用减弱，导致IL-10和IL-4过度分泌，机体免疫平衡失调，肺结核病情加重。

综上所述，肺结核患者外周血Vδ2+T淋巴细胞所占比例降低，IFN-γ、IL-10、IL-4水平升高；IL-10和IL-4可能参与肺结核的发生发展过程，其分泌可能受到Vδ2+T淋巴细胞的调节。