1例产前诊断罕见β-地中海贫血的分析

梁 毅，宁思思，陈 晓

(广西壮族自治区玉林市妇幼保健院检验科，广西玉林 537000)

地中海贫血是一组由于珠蛋白基因的缺陷导致珠蛋白合成障碍所引起的常染色体隐性遗传性溶血性疾病，其临床表型可从无症状到致命的溶血性贫血[1]。中国南方为地中海贫血高发地区，特别是广西当地人群地中海贫血基因携带率高达24.5%[2]。按照存在缺陷的珠蛋白基因的种类，地中海贫血一般可以分为α-、β-、δβ-和εγδβ-地中海贫血等类型，其中α-和β-地中海贫血最为常见[3]。目前该病尚无有效的治疗方法，只能通过对婚检、孕检夫妇以及胎儿进行准确的地中海贫血基因诊断或产前诊断，来杜绝中、重型患儿的出生，从而降低出生缺陷的概率[2]。地中海贫血基因突变一般分为点突变及缺失突变。目前国内地中海贫血基因诊断的常规检测范围为常见的3种缺失型α-地中海贫血、3种点突变型α-地中海贫血和17种点突变型β-地中海贫血，涵盖了中国人群中95%以上的α-和β-地中海贫血致病基因缺陷，但仍有5%罕见或未知突变未能进行检测[4]。在研究及临床工作中会发现一些基因型与表型不符或者与遗传规律不符的结果，提示该基因型可能是罕见或未知的，如不做进一步检测，则有可能出现误检、漏检等情况，严重时可能会导致重型地中海贫血患儿的出生。本文通过回顾性分析1例罕见重型β-地中海贫血的诊断及基因检测过程，探讨罕见地中海贫血的产前诊断策略。

1 资料与方法

1.1一般资料 孕妇39岁，其丈夫，46岁，夫妇双方均为广西籍人。夫妇在县级医院检查时发现双方的血液学表型均为红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)降低，且夫妇双方的血红蛋白电泳分析结果显示血红蛋白A2(HbA2)升高。该结果提示为小细胞低色素性贫血，夫妇遂到本院进行进一步的地中海贫血相关的检查。孕妇常规地中海贫血基因诊断结果为α-和β-地中海贫血均存在突变。其丈夫的基因结果也为α-和β-地中海贫血均存在突变。夫妇同型β-地中海贫血，符合产前诊断指征。签署产前诊断知情同意书后，孕妇于孕17+5周抽取羊水对胎儿进行产前地中海贫血基因检测。

1.2标本采集 受检孕妇及其丈夫分别用真空抗凝采血管采集外周静脉血3管，每管约3 mL，分别用于血常规分析、血红蛋白电泳分析和地中海贫血基因分析。胎儿羊水标本的采集是在超声引导下，对受检孕妇行羊膜腔穿刺术抽取羊水15 mL左右，并分装到2个15 mL的无菌离心管中，每管6～8 mL，其中1管直接进行地中海贫血基因检测，另1管则经过细胞培养后利用羊水贴壁细胞再进行基因检测。

1.3血液学一般检查 采用全自动血液分析仪(购自日本Sysmex公司，型号XE-5000)对受检孕妇及其丈夫的静脉血进行常规检测；采用全自动高压毛细管电泳仪(购自法国Sebia公司，型号Capillarys 2 Flex Piercing)按照仪器和配套试剂的操作说明书对血红蛋白电泳和定量进行检测、分析。

1.4标本DNA提取 上述所采集的标本均使用全血DNA(溶液型)核酸提取试剂盒(购自中国深圳亚能生物技术有限公司)进行基因组DNA提取；用核酸蛋白检测仪检测提取得到的DNA样本的浓度及纯度。要求提取的DNA样本浓度≥20 ng/μL且纯度A260/280=1.7～1.9。

1.5常见地中海贫血基因检测 目前常见的3种缺失型α-地中海贫血为-SEA、-α3.7、-α4.2，常用多重跨越断裂点聚合酶链式反应(Gap-PCR)方法来检测。常见的3种点突变型α-地中海贫血(CS、QS、WS)和17种点突变型β-地中海贫血CD41-42、CD43、IVS-Ⅱ-654、-28、-29、-32、CD71-72、βE、CD17、CD31、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CAP+1、Int、-30)一般使用聚合酶链式反应/反向点杂交法(RDB-PCR)来检测[1,4]。采用相应类型的地中海贫血基因检测试剂盒(购自中国深圳亚能生物技术有限公司)进行常见地中海贫血的检测，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.6β-珠蛋白基因序列检测 吸取受检孕妇及其丈夫的静脉血1 mL分别置于1.5 mL的小型离心管中，将培养好的部分胎儿羊水贴壁细胞也置于1.5 mL的小型离心管中，做好标记和说明，然后寄送到中国深圳亚能生物技术有限公司进行β-珠蛋白基因序列的测序。

2 结 果

2.1血液学检测结果 受检孕妇及其丈夫的血常规和血红蛋白电泳结果显示，孕妇及其丈夫的MCV和MCH均减低，提示二者均可能有小细胞低色素性贫血。孕妇及其丈夫的血红蛋白电泳结果显示HbA2和HbF均升高。综合分析二者的血液学结果，判断为地中海贫血初筛阳性。见表1。

表1 受检孕妇及其丈夫血液学检查结果

表2 受检孕妇、其丈夫及胎儿的地中海贫血基因检查结果

2.2常见地中海贫血基因的检测结果 常见地中海贫血基因检查结果表明，受检孕妇发现基因型为-α4.2/αα、41-42M/βN，同时携带有α-和β-地中海贫血。其丈夫地中海贫血基因检测结果为-α3.7/αα、-28M/βN，也是同时携带有α-和β-地中海贫血。胎儿发现基因型为αα/αα、41-42M/41-42M，从结果可以看出α-地中海贫血基因检测无异常，存在β-地中海贫血，但是β-地中海贫血的基因型不符合遗传学规律。为了保证结果的准确性，对上述三者的地中海贫血基因检测了进行复查，复查结果与第1次结果一致。受检孕妇否认非亲子可能。为了寻找β-地中海贫血的基因型不符合遗传学规律的原因，遂对三者的β-珠蛋白基因进行了测序。见表2、图1。

注：A表示正常对照；B表示受检孕妇；C表示孕妇的丈夫；D表示胎儿(羊水)
图1 β-地中海贫血RDB-PCR结果

2.3β-珠蛋白基因序列的检测结果 测序结果显示，孕妇的β-珠蛋白基因存在CD41-42(-TTCT)突变杂合子，与常见地中海贫血基因检测结果一致。其丈夫的β-珠蛋白基因测序结果除了检测到常见地中海贫血基因所检测到的-28(A->G突变外，还发现了罕见的CD43(GAG→AAG)突变见。胎儿(羊水)的测序结果为同时存在CD41-42(-TTCT)突变和罕见的CD43(GAG→AAG)突变。胎儿的β-珠蛋白基因测序结果符合遗传学规律。见图2。

注：A结果表示受检孕妇；B、C结果表示孕妇的丈夫；D、E结果表示胎儿(羊水)；箭头所指位点为突变位点
图2 β-珠蛋白基因测序结果

3 讨 论

地中海贫血是世界上最常见的血红蛋白病之一，其分子基础较为复杂且突变类型繁多[3]。目前世界上α-珠蛋白基因突变多达300多种，中国人群中发现约22种，β-地中海贫血突变多达200多种，中国人群中已报道的约46种[5-6]。目前，常规的地中海贫血基因检测只涵盖了常见的3种缺失型和3种点突变型α-地中海贫血以及17种点突变型β-地中海贫血，无法检测该范围外的较为罕见或未知的地中海贫血类型。宋春林等[7]研究发现，用二代高通量测序方法检测1 368例标本，共发现523例阳性结果，比常规方法多发现了25例，检出率提高了4.81%。由此可见罕见及未知类型地中海贫血在地中海贫血中占有一定的比例，如不做进一步检测，则容易出现漏诊、误诊，从而延误产前诊断，更严重的会导致重型地中海贫血患儿的出生。

在本研究中，前期发现受检孕妇及其丈夫的血常规检查结果均显示为地中海贫血初筛，经遗传咨询后双方进行了地中海贫血基因检测。常见地中海贫血基因检测结果显示夫妇双方均为地中海贫血携带者，且两人有同型β-地中海贫血，符合产前诊断指征，因此抽取胎儿羊水进行常见地中海贫血基因产前诊断。单从结果分析，胎儿基因型为αα/αα、41-42M/41-42M，为β-地中海贫血纯合子突变，属于重型地中海贫血。但结合孕妇及其丈夫的地中海贫血基因型分析后发现，胎儿的基因型不符合遗传学规律。为了寻找导致这一现象的发生原因，笔者首先对所有检测结果进行了复查，复查基因型与第1次基因型一致，排除做错标本的可能性。经询问后，受检孕妇否认非亲子可能。最后考虑是否为罕见地中海贫血影响了检测。对三者的β-珠蛋白基因进行了测序，结果发现，孕妇的丈夫为β-珠蛋白基因-28突变合并罕见的CD43(GAG→AAG)突变的双重杂合子，胎儿遗传了来自母亲的β-珠蛋白基因41-42突变及父亲的CD43(GAG→AAG)突变，也是双重杂合子，结果符合遗传学规律。β-珠蛋白基因CD43(GAG→AAG)突变是1种极为罕见的异常血红蛋白突变，目前关于该突变的报道还比较少。2008年HOYER等[8]报道了在白种人群中发现了这一突变。直到2010年，莫桂玲等[9]在中国人群中首次发现了这种突变，ZHAO等[10]在2017年也在中国人群中检测到了该突变。这种突变是导致常规检测所得结果不符合遗传学规律重要原因，因为该突变刚好在β膜条上41-42N探针所覆盖的范围附近，导致41-42N探针杂交不上去，最终导致β膜产品41-42N位点不显色，结果判读时便被判读为41-42M/41-42M纯合子。由此可见，有些罕见地中海贫血的存在可能会影响到常规地中海贫血基因检测的结果，从而影响检测的准确性，导致误诊。这也提示在进行胎儿地中海贫血基因产前诊断时，需结合其父母的地中海贫血基因结果联合判断。同时也提示当常规基因检测结果与临床表型不吻合时，应考虑该结果是否含有罕见或未知的地中海贫血类型，当与遗传规律不符的结果时，也应考虑该结果是否含有罕见或未知的地中海贫血类型。

综上所述，建议地中海贫血产前诊断的诊断策略：首先应严格按照地中海贫血筛查到诊断的步骤对可疑的夫妇进行检查，胎儿的地中海贫血基因检查结果应结合其父母的基因结果综合分析。特别是存在父母一方存在检测结果与临床表型不吻合的情况或胎儿结果不符合遗传学规律时，需应用基因测序等方法进一步检测，联合应用多种方法进行确诊，避免漏诊、误诊，从而避免重型地中海贫血患儿的出生。这对减缓社会压力和实现优生优育具有重要的意义。