丙型肝炎病毒核酸定量检测性能验证及评价

郭 杰，曲 沛，李韦杰，周 宇，郭晶晶，焦炳欣，王雅杰

研究认为HCV是引起90%～95%输血后肝炎的主要病原体[1-4]。据WHO统计，全球约有2亿人感染HCV，并面临发生肝硬化和/或肝癌的风险[5]。目前，血清HCV RNA定量检测是实验室诊断丙型肝炎的金标准。及时准确的检测对于HCV感染者的诊断和预后具有至关重要的意义。其中HCV RNA商品试剂盒分析性能评价是保证检验结果准确可靠的重要依据之一。根据中华人民共和国卫生行业标准《临床实验室对商品定量试剂盒分析性能的验证（WS/T 420-2013）》[6]规定，当我国食品药品监督管理局批准的检验方法或试剂盒进行了重要修改时，应对厂家制定的各项主要分析性能指标进行验证，依据《美国临床实验室改进修正法规88》要求，临床实验室可只对下列3项主要分析性能进行验证：正确度、精密度和线性（测量区间）。北京地坛医院所采用的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒自18012511批号开始，检出限由250 IU/ml改为50 IU/ml，为验证在当前实验条件下该试剂盒检出限是否达到厂家制定的分析指标，我们对该试剂盒的性能进行了符合补充验证。

1 材料与方法

1.1 标本 收集首都医科大学附属北京地坛医院检验科不同浓度的临床血清（血浆）标本共30例，标本浓度尽量涵盖线性范围，于-20℃冰箱保存。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量扩增仪（美国，罗氏 cobas®Z480）。丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（上海科华，批号18012511）。HCV RNA标准物质GBW（E）090140（北京康彻思坦生物有限公司，批号：201801001）。

1.3 性能验证指标及验证方法 根据中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 420-2013）[6]、EP9-A2[7]和中华人民共和国医药行业标准（YY/T 1182-2010）[8]对上海科华丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒进行正确度、精密度、线性、检测限和抗干扰能力的验证。

1.3.1 正确度 收集后的标本在1周内使用待验证的丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒集中检测，并将结果与罗氏检测系统的检测结果进行比对。检测结果与靶值之间绝对偏R≥0.95。

1.3.2 精密度 批内精密度：选择浓度为1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml的临床血清/血浆样本各1例，在同一批实验中重复测定20次，计算均值（）、标准差（SD）和变异系数（CV）值，要求CV≤5%。

批间精密度：将浓度为1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml 的2个标本，在同一批试验中重复检测4次，连续检测5 d，每个水平共收集20个数据；如果出现失控，则应剔除该数据并重新测定。分别统计2个水平标本检测值的和SD，再计算CV值，要求CV≤5%。

1.3.3 线性范围 选择临床浓度为5.00E+7 IU/ml的血清/血浆样本，用阴性血清按10倍梯度稀释至2.50E+2 IU/ml，对高值阳性标本和稀释后的标本进行同批次检测，每个浓度重复检测3次，对测定值和理论值进行线性回归分析，要求满足b在0.97～1.03范围内，a接近于0，R2≥0.95[9-10]。

1.3.4 检测限 取北京康彻思坦生物有限公司提供的HCV RNA标准物质GBW（E）090140（批号201801001），用阴性血清稀释至该试剂盒标定的检测限（50 IU/L）。依据YY/T1182-2010的要求，重复检测该稀释样本25次，检出22次及以上即为合格。

1.3.5 抗干扰能力 分别取高浓度（1.00E+5 IU/ml）与低浓度（1.00E+3 IU/ml）的HCV血清样本，和含相应的干扰物质（胆红素、血红蛋白和甘油三酯）的血清分别按1∶1进行混合，制成抗干扰样本。混合后血清对应所含干扰物浓度分别为：胆红素20 mg/ml，血红蛋白2 g/dl，甘油三酯5 g/dl。将每个混合品重复检测3次，与之前的定值进行比较，绝对偏差＜±0.5 lg即为合格。

2 结 果

2.1 正确度验证 30例含HCV RNA标本检测结果与罗氏检测系统比对，检测结果与靶值之间绝对偏差均在±0.5 lg内，回归方程为y=0.9881x-0.0972，R=0.998＞ 0.95。结果见表1。

表1 正确度验证结果Table 1 Results of accuracy verification

2.2 精密度验证

2.2.1 批内精密度验证 采用浓度为1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml高、低2个水平的临床样本，在同一批试验中重复检测20次；分别统计2个水平标本检测值的和SD，再计算CV值。高、低浓度对数值的CV分别为1.86%和2.64%，均符合CNAS-CL36规定的CV≤5%的要求。结果见表2。

表2 批内精密度验证结果Table 2 Results of intra-assay precision verification

2.2.2 批间精密度验证 采用浓度为1.00E+6 IU/ml和1.00E+3 IU/ml高、低2个水平的临床样本各1例进行批间精密度的验证。分别统计2个水平标本检测值的和SD，再计算CV值。高、低浓度对数值的CV值分别为1.44%和2.36%，均符合CNAS-CL36规定的CV≤5%的要求。结果见表3。

表3 批间精密度验证结果Table 3 Results of inter-assay precision verification

2.2.3 线性范围验证 将高值阳性标本5.00E+7 IU/ml梯度稀释至2.50E+2 IU/ml，实际值和理论值的回归方程是y=1.0193x-0.1617（R=0.9996≥0.98），满足b在0.97～1.03范围内，a接近于0，R2=0.9994≥0.95，线性范围为2.50E+2～5.00E+7 IU/ml。试剂说明书标定的定量线性范围为1.00E+3～1.00E+7 IU/ml，验证合格。结果见表4。

2.2.4 检测限验证 取北京康彻思坦生物有限公司提供的HCV RNA标准物质，用阴性血清稀释至50 IU/ml。重复检测该稀释样本30次，其中27次检出阳性，阳性率为90%，高于行业标准所要求的22/25，即阳性率88%的要求，故50 IU/ml作为该试剂盒的检出限，符合临床要求。结果见表5。

2.2.5 抗干扰能力 分别将高浓度、低浓度的HCV RNA血清样本和相应干扰物质血清按1∶1进行混合，混合后各血清物质所含干扰物浓度分别为胆红素20 mg/ml，血红蛋白2 g/dl，甘油三酯5 g/dl。将每个混合品重复检测3次，与之前定值进行比较，绝对偏差均＜±0.5 lg。结果见表6～7。

3 讨 论

生产厂家推出新试剂盒前，应对其进行系统评估。在ISO18113-2:2009[10]中明确提出生产厂家应向使用者提供一系列分析性能指标，包括：精密度、正确度、线性、特异性、最低检出限等。当临床实验室使用已经通过厂家严格评估或已经通过SFDA批准的试剂盒进行重要修改时，须要验证相关分析性能，以证实在本实验室能达到厂家制定的分析性能指标，从而保证检验结果的准确性。

该待验证HCV RNA定量检测试剂盒自18012511批号开始检测限由250 IU/ml改为50 IU/ml，其最低检测下限发生了改变。因HCV RNA具有不稳定性、易降解、易污染的特点，对实验环境、设备和操作人员的要求较高。本课题组在当前实验条件下对该试剂盒的检出限、正确度、精密度、线性范围逐一进行验证，评价其性能。

在检测限验证过程中，我们对浓度值为50 IU/ml的稀释样本重复检测30次，有27次浓度值＞50 IU/ml，即阳性率为90%，高于行业标准所要求的88%。50 IU/ml作为该试剂盒的检测限，符合行业要求。但我们发现其余3次检测中，有1次未检出，另外2次检测结果虽为阳性，但检出浓度均＜50 IU/ml；在实际的临床工作中，如果实验室将HCV RNA的最低检测下限定为50 IU/ml，患者样本在该浓度时不能保证100%被检出，易导致医患纠纷，因此在制定试剂盒HCV RNA的最低检测下限时，建议＞50 IU/ml。而在线性验证过程中，在2.50E+2～5.00E+7 IU/ml分析测量范围内线性关系良好（R=0.9996），建议该试剂盒的检测下限定为250 IU/ml。

表4 线性范围验证结果Table 4 Results of linear range verification

表5 检出限验证结果Table 5 Results of detection limit verification

表6 HCV RNA高浓度血清抗干扰能力检测结果Table 6 Results of HCV RNA high-concentration serum samples anti-interference ability

表7 HCV RNA低浓度血清抗干扰能力检测结果Table 7 Results of HCV RNA low-concentration serum samples anti-interference ability

研究结果显示，在正确度验证中，该检测试剂与比对试剂的检测结果高度相关，R2=0.996，R=0.998；在2.07E+3～1.05E+6 IU/ml浓度范围具有较好的批内精密度和批间精密度，符合CNASCL36的要求（CV均＜5%）；在抗干扰验证中，阳性血清中分别加入含有干扰物质（胆红素、血红蛋白、甘油三酯）的血清，分别与之前的定值进行比较，绝对偏差均＜±0.5 lg，检测结果符合临床需求。