不同配伍比例栀子-肉桂水提物改善小鼠睡眠作用及相关机制研究

杜正彩，齐彪，张明哲，韦燕霞，李丽洁，郝二伟，侯小涛，胡小勤，邓家刚，*

（1.广西中医药大学科学实验中心，广西南宁530001；2.广西中医药大学药学院，广西南宁530001；3.广西中药药效研究重点实验室，广西南宁530001）

失眠属于中医“不寐”、“不得眠”、“不得卧”、“目不瞑”等范畴，其病因病机多与心肾阴阳失调有关[1-2]，《辨证录》中记载：“人有昼夜不能寐，心甚烦躁，此心肾不交也........心肾之所以不交者，心过于热，而肾过于寒也”。交泰丸是治疗心肾不交所致失眠的经典名方，现代药理表明交泰丸镇静、催眠药效以原方黄连-肉桂10 ∶1 效果最佳[3-5]。第六批全国老中医药专家学术继承指导老师邓家刚教授根据长期从事临床和中药研究的实践，并结合经典名方“交泰丸”的立意，选用肉桂、栀子两味药食两用的药材，组成“桂栀助眠方”，用于辅助治疗心肾不交，心火偏亢所致的失眠症。栀子具有清心除烦之功效[6]，其有效成分栀子黄色素或藏红花酸具有改善睡眠的作用，且高剂量的栀子苷具有缩短小鼠入睡时间，提高小鼠入睡率[7-10]。肉桂具有补火助阳，引火归元之功效[6]，肉桂挥发油中桂皮醛具有镇静作用[11]。本文通过观察不同质量比例栀子-肉桂水提物对小鼠改善睡眠作用，筛选最佳质量比例，通过检测最佳质量比例小鼠脑内γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）及 5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的含量，探讨相关作用机制，为后期开发桂栀助眠胶囊保健食品提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF 级昆明种小鼠：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，体重（20±2）g，雄性 150 只，许可证号 SCXK（湘）2016-0002。

1.2 试材与试剂

栀子：南宁市京昌中药饮片有限公司，批号：20170701；黄连：广东汇群中药饮片股份有限公司，批号：20170902；肉桂：南宁生源中药饮片有限责任公司，批号：20170901；地西泮片：上海上药信谊药厂有限公司，批号14170401W；生理盐水：辰欣药业股份有限公司，批号：170829072；巴比妥钠、戊巴比妥钠：Sigma 公司；GABA：武汉华联科生物科技有限公司，批号201804；5-HT：武汉华美生物工程有限公司，批号：V24010401。

1.3 仪器

HDM-500 恒温电热套：江苏天由有限公司；HH-S8数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；FD56 恒温鼓风干燥箱：上海合测实业有限公司；Infinite M200 Pro 多功能酶标仪：上海道尚生物科技有限公司；TGL-16M型医用离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限；METTLER TOLEDO ME204 万分之一电子分析天平：武汉宏锦科技有限公司。

2 方法

2.1 实验药物制备

2.1.1 栀子-肉桂水提物（10 ∶1，质量比）制备

取肉桂粗粉40 g，加8 倍水浸泡1 h，蒸馏5 h，收集挥发油，蒸馏后的水溶液滤过另器收集；取栀子粗粉400 g，用10 倍量的水浸泡1 h，再加入肉桂残渣煎煮3 次，每次0.5 h。滤过，合并滤液与上述蒸馏水溶液，常压浓缩至1 mL 药液相当于原药材1 g，60 ℃水浴蒸发水分，常压60 ℃干燥至恒重，置干燥器冷却1 h。干膏研成粉末状，使用前将肉桂挥发油混入药粉，置4 ℃冰箱备用。

2.1.2 栀子-肉桂水提物（5 ∶1，质量比）制备

称取肉桂80 g，栀子400 g，其他条件均同2.1.1。

2.1.3 栀子-肉桂水提物（1 ∶1，质量比）制备

称取肉桂200 g，栀子200 g，其他条件均同2.1.1。

2.2 改善睡眠功能评价方法

2.2.1 直接睡眠实验与延长戊巴比妥钠睡眠时间实验

参照文献[12]方法，选取昆明种小鼠50 只，随机分为5 组：设阴性对照组（生理盐水）、西药阳性对照组（地西泮 1.51 mg/kg）、10 ∶1、5 ∶1、1 ∶1（质量比）栀子-肉桂水提物组（0.59 g/kg 相当于成人剂量的20 倍），每组10 只，各组小鼠每天经口灌胃10 mL/（kg·d），连续30 d。第29 天给小鼠灌胃60 min 后，以动物的翻正反射消失超过30 s～60 s 判为进入睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒，观察各组小鼠给予受试物入睡动物数；第30 天，灌胃15 min 后，给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠44 mg/kg，注射量为10 mL/kg，以翻正反射消失1 min 为指标，观察受试样品能否延长戊巴比妥能否延长睡眠。

2.2.2 戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验

受试样品给予时间设计同“2.2.1”，小鼠末次灌胃15 min 后，给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠最大阀下剂量32 mg/kg，注射量10 mL/kg，记录30 min 内各组入睡动物数（翻正反射消失达1 min 以上者）。

2.2.3 巴比妥钠睡眠潜伏期实验

剂量分组及受试样品给予时间设计同“2.2.1”，小鼠末次灌胃15 min 后，给各组小鼠腹腔注射巴比妥钠剂量280 mg/kg，注射量10 mL/kg，以翻正反射消失1 min 为指标，观察受试样品对巴比妥钠睡眠潜伏期的结果。

2.3 对小鼠脑内GAGA、5-HT含量的影响

根据延长戊巴比妥钠睡眠时间实验结果，选取栀子-肉桂 10 ∶1 组、5 ∶1 组、1 ∶1 组（质量比）、阴性对照组（生理盐水）小鼠，按0.59 g/kg 继续灌胃14 d 后，脱颈椎处死小鼠，冰浴开颅取全脑后，在冰平皿上分离大脑后，用冰生理盐水冲洗血液，滤纸拭干，大脑称重后，将9 倍量的冰生理盐水手动均浆，取浆液至2 mL离心管中离心（3 000 r/min，15 min，4 ℃），取上清液，按照试剂盒相关操作步骤测定样品中GAGA、5-HT 的OD 值，并带入标准曲线回归方程式，计算样品中GAGA、5-HT 的浓度[13]。

2.4 统计方法

采用SPSS 22.0 进行统计分析，直接睡眠小鼠入睡率和戊巴比妥钠阀下剂量入睡率为计数资料，采用卡方检验；其余指标为计量资料，实验数据采用表示，组间采用单因素方差分析，方差齐性组间进行最小显著性差异法（least significant difference，LSD）检验，方差不齐者采用Tamhane's T2 检验。

3 结果

3.1 各实验组对小鼠体重的影响

各实验组栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响见表1～表3。

表1 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（延长戊巴比妥钠睡眠时间组，n=10）Table 1 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on extending the sleep time of pentobarbital sodium，，n=10）

表1 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（延长戊巴比妥钠睡眠时间组，n=10）Table 1 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on extending the sleep time of pentobarbital sodium，，n=10）

组别 剂量/[g/（kg·bw）]初期体重/g 中期体重/g 末期体重/g阴性对照 0 18.25±1.23 36.26±2.79 42.42±2.12栀子-肉 10∶1 0.59 18.05±1.23 36.79±2.70 42.16±3.57栀子-肉桂 5∶1 0.59 18.30±1.10 37.54±3.12 42.45±4.14栀子-肉桂 1∶1 0.59 18.12±1.06 35.05±2.43 41.49±2.60地西泮片 0.001 5 18.09±1.31 37.17±2.62 43.75±4.44

表2 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（戊巴比妥钠阀下剂量组，，n=10）Table 2 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on sodium pentobarbital（subthreshold doses），，n=10）

表2 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（戊巴比妥钠阀下剂量组，，n=10）Table 2 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on sodium pentobarbital（subthreshold doses），，n=10）

组别 剂量/[g/（kg·bw）]初期体重/g 中期体重/g 终体重/g阴性对照 0 18.22±1.24 35.40±2.76 42.70±2.86栀子-肉桂 10∶1 0.59 18.13±0.89 36.08±3.30 40.11±3.87栀子-肉桂 5∶1 0.59 18.23±1.34 34.91±3.91 40.20±4.37栀子-肉桂 1∶1 0.59 18.21±0.85 34.95±3.61 40.11±2.91地西泮片 0.001 5 18.43±1.05 35.82±3.96 42.65±4.65

实验结果表明，在延长戊巴比妥钠睡眠时间组、戊巴比妥钠阀下剂量组、巴比妥钠睡眠潜伏期组中，各组小鼠体重与阴性对照组相比无明显差异（P＞0.05），表明栀子-肉桂不同质量比例对小鼠的体重无明显影响。

表3 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（巴比妥钠睡眠潜伏期组，，n=10）Table 3 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on sleeping incubation period induced by barbital sodium，，n=10）

表3 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠体重的影响（巴比妥钠睡眠潜伏期组，，n=10）Table 3 The Effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the weight of mice（The case on sleeping incubation period induced by barbital sodium，，n=10）

组别 剂量/[g/（kg·bw）]初期体重/g 中期体重/g 终体重/g阴性对照 0 18.19±1.20 33.66±2.51 43.48±3.24栀子-肉桂 10∶1 0.59 18.31±1.36 34.11±4.73 41.21±4.86栀子-肉桂 5∶1 0.59 18.06±1.21 35.67±2.70 40.64±2.35栀子-肉桂 1∶1 0.59 17.95±1.05 36.73±2.88 42.00±4.01地西泮片 0.001 5 18.08±1.19 34.40±2.36 41.12±4.43

3.2 各实验组对小鼠直接睡眠的影响

栀子-肉桂不同质量比例对小鼠直接睡眠的影响见表4。

表4 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠直接睡眠的影响（，n=10）Table 4 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on immediate sleep of mice（，n=10）

表4 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠直接睡眠的影响（，n=10）Table 4 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on immediate sleep of mice（，n=10）

组别 剂量/[g/（kg·bw）]动物数 入睡动物数 入睡率/%阴性对照 0 10 0 0栀子-肉桂 10∶1 0.59 10 0 0栀子-肉桂 5∶1 0.59 10 0 0栀子-肉桂 1∶1 0.59 10 0 0地西泮片 0.001 5 10 0 0

结果表明，各组动物在1 h 内均未出现睡眠现象，表明栀子-肉桂不同质量比例对小鼠无明显直接催眠作用，可通过其他3 项实验确定配方筛选。

3.3 延长戊巴比妥钠睡眠实验影响

栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠睡眠时间的影响见表5。

表5 栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠睡眠时间的影响（，n=10）Table 5 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on sleep time of pentobarbital sodium（，n=10）

表5 栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠睡眠时间的影响（，n=10）Table 5 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on sleep time of pentobarbital sodium（，n=10）

注：与阴性对照组比较，2）P＜0.01，差异极显著。

组别 剂量/[g/（kg·bw）]戊巴比妥钠剂量/[mg/（kg·bw）]睡眠时间/min阴性对照 0 44 37.05±20.64栀子-肉桂 10∶1 0.59 44 50.45±26.89栀子-肉桂 5∶1 0.59 44 56.10±23.002）栀子-肉桂 1∶1 0.59 44 42.10±25.63地西泮片 0.001 5 44 91.20±25.572）

结果表明，与阴性对照组相比，栀子-肉桂质量比5 ∶1 组、地西泮组能延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间（P＜0.01）；其余各组结果无显著性差异（P＞0.05）；栀子-肉桂不同质量比例组延长小鼠睡眠时间作用趋势为 5 ∶1 组＞10 ∶1 组＞1 ∶1 组。

3.4 戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验影响

栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠阀下剂量入睡率的影响见表6。

表6 栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠阀下剂量入睡率的影响（，n=10）Table 6 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on sleep rate of sodium pentobarbital（subthreshold doses）（，n=10）

表6 栀子-肉桂不同质量比例对戊巴比妥钠阀下剂量入睡率的影响（，n=10）Table 6 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on sleep rate of sodium pentobarbital（subthreshold doses）（，n=10）

注：与阴性对照组比较，1）P＜0.05，差异显著；2）P＜0.01，差异极显著。

入睡动物数组别 剂量/[g/（kg·bw）]戊巴比妥钠剂量/[mg/（kg·bw）]动物数入睡率/%阴性对照 0 32 10 2 20栀子-肉桂10∶1 0.59 32 10 6 60栀子-肉桂5∶1 0.59 32 10 8 801）栀子-肉桂1∶1 0.59 32 10 5 50地西泮片 0.0015 32 10 9 902）

结果表明，与阴性对照组相比，栀子-肉桂质量比5 ∶1 组、地西泮组能增加戊巴比妥钠域下剂量小鼠入睡率（P＜0.05，P＜0.01），栀子-肉桂不同质量比例组增加小鼠入睡率作用趋势为质量比 5 ∶1 组＞10 ∶1 组＞1 ∶1 组。

3.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验影响

栀子-肉桂不同质量比例对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响见表7。

表7 栀子-肉桂不同质量比例对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响（，n=10）Table 7 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the sleeping incubation period induced by barbital sodium（，n=10）

表7 栀子-肉桂不同质量比例对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响（，n=10）Table 7 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on the sleeping incubation period induced by barbital sodium（，n=10）

注：与阴性对照组比较，2）P＜0.01，差异极显著。

睡眠潜伏期时间/min阴性对照 0 280 29.50±4.20栀子-肉桂 10∶1 0.59 280 23.40±4.222）栀子-肉桂 5∶1 0.59 280 26.30±3.40栀子-肉桂 1∶1 0.59 280 27.70±5.06地西泮片 0.001 5 280 15.80±2.822）组别 剂量/[g/（kg·bw）]巴比妥钠剂量/[mg/（kg·bw）]

结果表明，与阴性对照组相比，栀子-肉桂质量比10 ∶1 组、地西泮组均能缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期（P＜0.01）；栀子-肉桂不同质量比例组缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期作用趋势为质量比 10 ∶1 组＞5 ∶1 组＞1 ∶1 组。

3.6 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠脑内GABA及5-HT含量的影响

3.6.1 GABA、5-HT 标准曲线建立

将浓度分别为 32、16、8、4、2、0 nmol/L 的 GABA 标准品按照试剂盒操作步骤，以标准品的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，绘制标准曲线的直线回归方程式：y=0.028 1x＋0.027 1（R2=0.989 83），结果见图1；将浓度分别为 4 000、2 000、1 000、500、250、0 pg/mL 的5-HT 标准品按照试剂盒操作步骤，以标准品的浓度为纵坐标（对数坐标），OD 值为横坐标（对数坐标），绘制标准曲线的对数回归方程式y=377.37-434.445In（x＋7.265×10-5）（R2=0.984 6），结果见图2。将样本 OD值带入以上标准曲线回归方程式，计算样品浓度。

图1 GABA 标准曲线Fig.1 GABA standard curve

图2 5-HT 标准曲线Fig.2 5-HT Standard Curve

3.6.2 对小鼠脑内GABA 及5-HT 含量的影响

栀子-肉桂不同质量比例对小鼠脑内GABA 和5-HT 的影响见表8。

结果表明，与阴性对照组相比，栀子-肉桂质量比5 ∶1 组能增加小鼠脑内的 GABA 含量（P＜0.05），栀子-肉桂不同质量比例各组对小鼠脑内5-HT 含量无明显影响（P＞0.05）。

表8 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠脑内GABA 和5-HT 的影响（，n=10）Table 8 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on GABA and 5-HT in mouse brain（，n=10）

表8 栀子-肉桂不同质量比例对小鼠脑内GABA 和5-HT 的影响（，n=10）Table 8 The effects of varied compatibility proportion of gardenia and Cinnamon cassia on GABA and 5-HT in mouse brain（，n=10）

注：×20：此样品检测前稀释 20 倍；与阴性对照组比较，1）P＜0.05，差异显著。

5-HT（×20）/（pg/mL）阴性对照 0 0.54±0.45 39 298.21±5 157.04栀子-肉桂 10∶1 0.59 0.82±0.47 38 963.88±2 720.95栀子-肉桂 5∶1 0.59 0.94±0.401） 36 606.72±2 445.51栀子-肉桂 1∶1 0.59 0.87±0.26 36 832.73±3 657.80组别 剂量/[g/（kg·bw）]GABA/（nmol/L）

4 结论与讨论

交泰丸源自《韩氏医通》，原书中提到“黄连......为君，佐官桂少许，煎百费，入蜜，空心服，能心肾交于顷刻”，至清代《四科简效方》记载“生川连五钱，肉桂心五分，研细，白蜜丸，空心淡盐汤下，治心肾不交、怔忡无寐，名交泰丸”。明确说明交泰丸用药组成为生川连与肉桂，其用药比例为10 ∶1。拟开发产品桂栀助眠胶囊是对经典名方交泰丸改良而研制的国产保健食品，是针对心火独亢，兼肾阳不足所致的失眠，由栀子、肉桂组成，栀子清心除烦，与黄连药效相似，因保健食品的原料药不允许使用黄连，故本产品采用药食两用的栀子代替黄连，故本课题组在借鉴古方用药比例的基础上设置栀子-肉桂质量比 10 ∶1、5 ∶1、1 ∶1 组。

本文研究结果表明栀子-肉桂质量比5 ∶1 组时，改善睡眠效果最好，分析原因如下：其一，在相同剂量情况下，随着处方中栀子所占比例越高，其活性成分栀子黄色素（藏红花酸）或栀子苷含量逐渐增加，药效越明显，其二，临床上对于心肾不交（心火亢盛、肾阳不足）所致的失眠症重在用栀子清心泻火，符合中医治疗原则。其三，栀子药性偏于苦寒，处方中栀子所占比重过大会伤及脾胃，从而影响有效成分在体内的生物利用度。提示栀子在处方的比重控制在合理的范围内。

γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统中一种重要的抑制性神经递质，能够抑制兴奋的神经元，对神经元有保护性作用，GABA 的异常与睡眠有密切的联系[14-15]。5-羟色胺（5-HT）是脑内一种重要的神经递质，对睡眠的调节起到关键作用，动物脑内5-HT 水平的减少可引起失眠，脑内5-HT 浓度升高，会产生睡意[16-17]。综上所述，5-HT 和GABA 是睡眠调控两类重要的神经递质，故本实验通过测定小鼠脑内神经递质5-HT和GABA 的含量，探讨最佳质量比例改善睡眠的作用机制。

本研究表明，经口给予小鼠不同受试物30 d，栀子-肉桂不同质量比例组在60 min 内，均未有直接睡眠现象；与阴性对照组相比，栀子-肉桂质量比5 ∶1 组能延长戊巴比妥钠小鼠睡眠时间（P＜0.05），且能增加戊巴比妥钠阀下剂量小鼠入睡率（P＜0.05）；栀子-肉桂质量比10 ∶1 组均能缩短巴比妥钠小鼠睡眠潜伏期（P＜0.05）；栀子-肉桂质量比 5 ∶1 组能增加小鼠脑内的GABA 含量（P＜0.05），栀子-肉桂不同质量比例组对小鼠脑内5-HT 含量无明显影响（P＞0.05）。本实验从整体和分子机制探讨了桂栀助眠方的最佳质量比例，通过对上述结果分析，栀子-肉桂质量比5 ∶1 组改善睡眠效果最佳，其作用机制可能与增加小鼠脑内GABA含量有关。