中国6个产地文旦柚皮精油化学成分及生物活性研究

卢锦澜，许梦圆，陈啸飞，秦昭，王文蜀，2，3，*，刘秋彤

（1.中央民族大学生命与环境科学学院化学实验中心，北京100081；2.北京食品环境与健康工程技术研究中心，北京100081；3.中央民族大学生命与环境科学学院转化神经科学中心，北京100081）

柚子[Citrus maxima（Burm.）Merr.]为芸香科柑橘属水果，主要生长于东南亚，在泰国、马来西亚、越南、印度尼西亚和日本南部均有种植[1]。我国柚类品种丰富，目前市场主流柚类品种有文旦柚、沙田柚和种间柚[2]，主要种植于我国东南部和南部地区[3]，年产量高达200 多万吨。除果肉外，柚皮也是一种风味独特的食材，其中含有对人体健康有良好促进作用的果胶、黄酮、精油和膳食纤维[4]等。基于其中的活性成分，柚皮的综合利用受到了广泛关注，已有研究主要集中在精油提取工艺[5]、化合物成分鉴定[6]和油脂抗氧化性质[7]等方面。

文旦柚 [Citrus maxima （Burm.）Merr.cv.Wendan Buntan]因其果型硕大，果肉脆嫩，风味浓郁而闻名[8]，是我国柚类产品的主流品种之一，广泛栽培于我国福建、浙江和广西等地[2]。有研究报道，精油化学成分会随植物种植地不同而发生变化[9]，并导致生物活性差异，例如，国外学者检测了不同产地黄金柑皮精油，发现其成分存在一定差异[10]。目前国内外对文旦柚皮精油化学成分和生物活性的研究相对较少，更缺少不同产地文旦柚皮精油成分的对比研究。因此为推进我国优质特色植物资源科学开发，提升文旦柚附加经济价值，试验采用水蒸气提取法提取我国6 个文旦柚主要产地的柚皮精油，通过气质联用的方法首次完成6 个文旦柚皮精油化学成分分析及比较，对六产地的精油进行抗菌和细胞毒活性测试，以期为文旦柚皮精油在食品香料、天然抗菌剂及功能性食品等方面的合理利用提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

文旦柚：2017年9月，福建莆田、福建泉州、福建南平、江西赣州、广西玉林、广东梅州6 个地区的文旦柚种植基地；人体肝癌细胞株HepG2（ATCC No.HB-8065）、人体宫颈癌细胞株 Hela（ATCC No.CCL-2）：北京城市学院生物医学部。

二氯甲烷（分析纯）、无水甲醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、蒸馏水、无水硫酸钠、碳酸钠、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：北京化工厂；细胞毒活性测试药品 [3-（4，5-diethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfophenyl）-2H-etrazolium，inner salt，MTS]：北京普洛麦格生物技术有限公司；顺铂：上海源叶生物科技有限公司；革兰氏阴性菌：大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 25922）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium，ATCC 14028）、福氏志贺菌（Shigella flexneri，ATCC 12022）；革兰氏阳性菌：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC 6633）、四联球菌（Micrococcus tetragenus，ATCC 35098）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）：中央民族大学生命与环境科学学院；琼脂培养基：北京酷来搏科技有限公司；96 孔板：美国 Corning 公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪（GCMS-QP2010）：日本岛津；电子调温加热套（98-1-B 型500 mL）：天津市泰斯特仪器有限公司；超声仪（KQ5200E 型）：昆山市超声仪器有限公司；电子分析天平（BSA224S）：北京赛多利斯仪器系统有限公司；旋转蒸发器（RE-2000）：上海洪旋实验仪器有限公司；挥发油提取装置（冷凝管、10 mL提取器、500 mL 圆底烧瓶）：北京玻璃仪器厂；恒温恒湿培养箱（LRH-250-S 型）：广东泰宏君科学仪器股份有限公司；酶标仪（EnSpire）：美国 Perkin Elmer 公司；超净工作台（SW-CJ-2G）：北京碧都空气净化设备公司。

1.3 方法

1.3.1 材料预处理

将新鲜的文旦柚洗净后，将柚皮（去除白色部分）切成小块（1 cm×1 cm）。

1.3.2 提取方法

参照2010 版《中华人民共和国药典》附录XD 中的甲法进行精油的提取，精确称取6 个不同产地文旦柚皮各50 g，分别置于500 mL 的圆底烧瓶中，加入少量的沸石，再加入适量的蒸馏水，提取5 h 直至精油不再增加。所得蒸馏液用二氯甲烷萃取3 次，静置分层后获取精油层，采用旋蒸仪除去二氯甲烷，再用无水硫酸钠干燥，密封后于-10 ℃下避光保存。

1.3.3 气相色谱与质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

GC 条件：采用 Rtx-5MS 柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯度氦气，流速为 1 mL/min，进样量为1 μL，进样口温度为250 ℃，不分流；初始温度为40 ℃，首先以 3 ℃/min 升至 220 ℃，然后以 30 ℃/min升至300 ℃，最后在300 ℃下保持10 min。

MS 条件：电离方式 EI，离子源温度 230 ℃，溶剂延迟时间4 min，电子能量70 eV，扫描范围35 m/z～500 m/z。

1.3.4 抗菌试验

采用微量肉汤稀释法[11]测定6 个不同产地文旦柚皮精油对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）来评价其抗菌活性。用接种环分别挑取6 种受试菌落置于不同试管中，并加入0.85 %灭菌生理盐水调整浊度，使其与标准0.5 号麦氏比浊管的浊度相同，配得到1.5 ×108CFU/mL 受试菌菌悬液。用DMSO 溶解各个待测精油，配得初始浓度为5 000 μg/mL 的精油溶液。在96 孔板选取3 排做同一菌种的重复试验，在每一排的所有孔内加入100 μL 肉汤后，在每一排的第一个孔中加入100 μL 精油溶液，用移液枪反复吹打使药物与肉汤充分混匀，采用二倍稀释法将精油浓度从左到右逐级递减，最后向每个孔加入100 μL 完成稀释的菌悬液。阴性对照仅含菌液和肉汤，空白对照为肉汤，并以盐酸左氟沙星作为阳性对照，测试方法与样品一致。上述所有操作均在超净工作台中进行。每组样品重复3 次。将96 孔板置于37 ℃恒温箱中培养24 h，无菌生长的澄清孔所对应的样品浓度为最小抑菌浓度。

1.3.5 细胞毒活性试验

采用MTS[12]法，评价6 个不同产地文旦柚皮精油对两种人体癌细胞株的细胞毒活性。分别取（2～5）×103的不同癌细胞株置于不同的96 孔板中过夜培养后，去除培养基，留下贴壁生长的癌细胞。向每个培养癌细胞的孔中加入100 μL 含有梯度浓度精油DMSO溶液的新培养基，在含有5%CO2的环境下，在37 ℃黑暗培养48 h。然后，向上述每个孔中加入20 μL MTS，在 37 ℃黑暗培养 90 min，于 490 nm 处测定吸光度。阴性对照组中不含样品溶液，顺铂作为阳性对照，测定方法同样品一致。

癌细胞生长抑制率运用以下公式计算：

癌细胞生长抑制率/%=[1-（A1-A0）/（A2-A0）]×100

式中：A0为空白对照的吸光度；A1为样品的吸光度；A2为阴性对照的吸光度。所得结果的细胞毒活性用半抑制浓度IC50（μg/mL）表示，即样品对人体癌细胞生长抑制率达到50%时的浓度。每个样品重复3次，最终结果表示为平均值±标准误差。

1.3.6 数据处理

利用SPSS Statistics 20.0 对6 个产地文旦柚皮精油化学成分的相对含量进行主成分分析和聚类分析。所有试验数据采用SPSS Statistics 20.0 和Microsoft Excel 2010 软件进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 文旦柚皮精油化学成分

经GC-MS 分析得到6 个产地文旦柚皮精油的总离子流图见图1。

采用峰面积归一化法得到6 个产地文旦柚皮精油中各化合物的相对含量见表1。

图1 6 个产地文旦柚皮精油GC-MS 总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of GC-MS of the essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

表1 6 个产地文旦柚皮精油化学成分Table 1 Chemical compounds in the essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

续表1 6 个产地文旦柚皮精油化学成分Continue table 1 Chemical compounds in the essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

通过检索美国国家标准与技术研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST） 数 据 库（https：//webbook.nist.gov/）并与相关文献报道[13-14]的保留指数（retention index，RI）进行比对，从 6 个产地的文旦柚皮精油中总共检测出54 种化合物，其中44 种为共有化合物，检出率分别为莆田样品98.13%、泉州样品96.69%、南平样品95.62%、赣州样品95.48%、玉林样品98.49%和梅州样品98.25%。通过表1 结果分析得出，6 个产地文旦皮精油的主要化合物类型为萜类化合物，相对含量为83.97%～89.81%。其中主要化合物为 d-柠檬烯（51.06～57.28%）、β-月桂烯（19.16%～27.95%）、诺卡酮（3.48%～5.27%）、顺式芳樟醇氧化物（0.21%～2.39%）、异松油烯（0.43%～2.01%）、反式芳樟醇氧化物（0.05%～2.06%）以及金合欢醇（0.21%～1.65%）。

各地文旦柚皮精油化学成分存在一些差别，其中莰烯（0.1%）仅在赣州样品内检出，α-石竹烯仅在莆田（0.14%）和玉林（0.04%）的样品中检出；梅州的样品中未检出十一烷，玉林的样品中未发现香芹烯。同时各类化合物的相对含量也具有明显差异，莆田样品中β-蒎烯含量（1.27%）约为其他样品的 2 倍～4 倍，β-月桂烯和d-柠檬烯含量在梅州样品中最高，分别为27.95%和57.28%。周永红等[15]报道，我国另一大柚类品种沙田柚皮精油中d-柠檬烯和β-月桂烯含量分别为62.48%和1.55%，前者与文旦柚皮精油中d-柠檬烯的含量相似，而后者则低于文旦柚中β-月桂烯含量，这种现象可能与柚子品种有关。除品种因素外，不同的提取方法也能导致精油成分差异，例如通过微波处理法所得柚皮精油中β-月桂烯和d-柠檬烯含量分别为8.33%和23.43%，水提法所得精油中β-月桂烯和d-柠檬烯含量分别为16.17%和35.66%[16]。

2.2 主成分分析与聚类分析

6 个产地文旦柚皮精油主成分分析见图2。

6 个产地文旦柚皮精油聚类分析见图3。

图2 6 个产地文旦柚皮精油主成分分析结果Fig.2 Principal component analysis of the essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

图3 6 个产地文旦柚皮精油聚类分析结果Fig.3 Hierarchical cluster analysis results of the essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

为了探究6 个产地文旦柚皮精油化学成分存在的差异性，对其进行主成分分析。6 个产地文旦柚皮精油化学成分存在化学变异性如图2a 所示，第一主成分（成分1）显示了6 个产地文旦柚皮精油化学成分33.56%的变异性，其与 β-蒎烯（CP3）、（Z）-β-罗勒烯（CP9）、芳樟醇（CP14）、癸醛（CP23）、橙花醇（CP25）、α-愈创木烯（CP38）、吉马烯 D（CP41）、瓦伦烯（CP42）和橙花叔醇（CP48）的相关系数大于0.9，呈现较高正相关性。第二成分（成分2）显示了6 个产地文旦柚皮精油化学成分20.63 %的变异性，其与α-水芹烯（CP5）、α-法呢烯（CP45）、δ-杜松烯（CP46）的相关系数大于0.83，具有较高正相关性。研究表明，来自不同采集地的同种植物的化学成分存在化学变异性，这可能与植物栖息地的各种环境因素有关，如海拔、降雨量、温度和土壤等[17]。

在主成分分析图中成分1（33.56 %）和成分2（20.63%）显示了6 个产地文旦柚皮精油50%以上的变异性，因此选用这两个主成分对6 个产地文旦柚进行分类分析，结果如图2-b 所示，莆田、泉州和赣州的样品可归为一类，它们的精油中主要单萜类化合物含量为75.40%～76.78%，主要倍半萜类化合物含量为1.98%～2.79%；南平和玉林的样品为一类，它们的精油中主要单萜类化合物含量分别为78.86%和80.23%，主要倍半萜类化合物含量分别为1.57%和1.27%；梅州样品单独为一类，其精油中主要单萜类化合物的含量高达85.23%，主要倍半萜类化合物的含量为0.74%。为了进一步得到6 个产地文旦柚间的化学变异距离及亲缘关系，通过聚类分析对6 个产地文旦柚进行分类，结果如图3 所示，聚类分析和主成分分析的结果一致，6 个产地的文旦被分为3 个簇，第一簇中包含福建莆田、福建泉州和江西赣州的文旦，来自福建南平和广西玉林的文旦为第二簇，广东梅州的文旦单独为一簇。

2.3 抗菌活性

6 个产地文旦柚皮精油抗菌活性见表2。

由表2 分析可知，文旦柚皮精油对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有一定抑制作用，其中对大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的抑制较为明显，MIC 范围为（156.25 μg/mL～1 250 μg/mL），对福氏志贺菌和四联球菌的抗菌效果相对较弱（MIC=312.5 μg/mL～2 500 μg/mL）。莆田样品对所有的受试菌显示出最强抑制活性（MIC=156.25 μg/mL～312.5 μg/mL），特别是对大肠杆菌（MIC=156.25 μg/mL）、鼠伤寒沙门氏菌（MIC=156.25 μg/mL）、枯草芽孢杆菌（MIC=156.25 μg/mL）和金黄色葡萄球菌（MIC=156.25 μg/mL）的抑制最为明显，其次是福氏志贺菌（MIC=312.5 μg/mL）和四联球菌（MIC=312.5 μg/mL）。泉州样品表现出较好的抗菌活性（MIC=312.5 μg/mL～625 μg/mL），尤其是对大肠杆菌（MIC=312.5 μg/mL）和金黄色葡萄球菌（MIC=312.5 μg/mL）。南平和梅州样品对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌显示出一致的MIC值，分别为 1 250 μg/mL 和 2 500 μg/mL。国内学者也曾报道金柚柚皮精油对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定抗菌活性[18]。

表2 6 个产地文旦柚皮精油抗菌活性（最小抑菌浓度）Table 2 Antimicrobial activities（MIC）in essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

2.4 细胞毒活性

6 个产地文旦柚皮精油细胞毒活性见表3。

6 种文旦柚皮精油对人体肝癌细胞株（HepG2）和人体宫颈癌细胞株（Hela）的抑制活性结果如表3 所示，6 个样品都表现出一定的抑制活性，其中莆田样品表现出较为显著细胞毒活性，其对人体肝癌细胞株的IC50值为37.45 μg/mL，对人体宫颈癌细胞株的IC50值IC50=43.13 μg/mL，其次是赣州样品，对人体肝癌细胞株和宫颈癌细胞株的IC50值分别为IC50=92.71 μg/mL和IC50=85.69 μg/mL，其他4 个样品对这两个细胞株的细胞毒活性较弱，IC50值均大于 100 μg/mL。

表3 6 个产地文旦柚皮精油细胞毒活性Table 3 Cytotoxicity in essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

2.5 文旦柚皮精油成分与生物活性相关性分析

6 个产地文旦柚皮精油活性成分与生物活性的相关系数见表4。

表4 6 个产地文旦柚皮精油活性成分与生物活性的相关系数Table 4 Correlation coefficient between active compounds and biological activity of the in essential oils of Wendan pomelo peels from six areas

植物精油成分极其复杂，其生物活性可能受多种活性成分协同作用影响。文献报道d-柠檬烯是一种抗菌活性化合物[19]，具有预防和治疗肝癌的作用[20]；石竹烯不仅具有显著的抗菌活性[21]，还能在不破坏正常细胞的情况下诱导人体癌细胞凋亡[22]；芳樟醇具有显著抗菌活性[23]和抗癌特性[24]；吉马烯D 具有抑菌[25]和抑制肝癌细胞的作用[26]；莰烯可诱导肿瘤细胞凋亡的能力[27]。因此，对文旦柚皮精油中这5 种主要活性成分的相对含量与两种生物活性试验数据进行相关性分析。

由表4 可知，d-柠檬烯、石竹烯和芳樟醇的相对含量与抗菌活性存在正相关性。其中d-柠檬烯和石竹烯的相对含量与样品抑制大肠杆菌、四联球菌和鼠伤寒沙门氏菌的活性存在显著正相关性（P＜0.05）；同时，d-柠檬烯的相对含量与样品抑制枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的活性存在显著正相关性（P＜0.05）。所有6 种文旦柚皮精油都含有丰富的d-柠檬烯，均显示了抗菌活性，因此，d-柠檬烯可能是文旦柚皮精油的主要抗菌活性成分之一。由于石竹烯和芳樟醇也被报道具有显著抗菌活性[21-23]，那么在d-柠檬烯相对含量相当的情况下，样品精油的抗菌活性差异可能也与这两种化合物含量相关。在莆田样品中，石竹烯（1.14%）和芳樟醇（0.69%）的相对含量最高，因此相较于其他样品显示出了更好的抑菌活性。5 种主要活性化合物的相对含量与细胞毒活性存在正相关性，其中d-柠檬烯和石竹烯的相对含量与样品对人体肝癌细胞株（HepG2）和人体宫颈癌细胞株（Hela）的细胞毒活性菌均存在显著正相关性（P＜0.05）。在莆田样品中，d-柠檬烯、石竹烯、芳樟醇及吉马烯D 的相对含量远高于其他样品，且表现最佳的细胞毒性，这4 种化合物可能是文旦柚皮精油的细胞毒活性成分。莰烯仅在赣州样品中被检测到，赣州样品的细胞毒活性成分仅次于莆田样品，因此，莰烯也可能是精油的细胞毒活性成分之一。

3 结论

本论文首次对我国6 个产地的文旦柚皮精油进行了化学成分、抗菌和细胞毒活性的研究与比较。从6个样品中总共鉴定出54 种化合物，其中44 个共有化合物，多为具有萜类骨架的醇类、酮类、醛类及其他化合物，主要化合物为d-柠檬烯，β-月桂烯和诺卡酮。通过主成分分析和聚类分析将6 个产地的文旦分为了3类，莆田、泉州和赣州的文旦归为第一类，南平和玉林的文旦为第二类，梅州文旦为第三类；抗菌试验结果显示6 种文旦柚皮精油都有抗菌活性，其中福建莆田样品抗菌活性最佳，福建泉州样品抗菌能力次之；细胞毒活性试验结果表明，福建莆田样品活性最强；相关性分析结果显示了文旦柚皮精油的化学成分差异导致其抗菌及细胞毒活性的不同，这种化学组成差异可能是与植物生长地的环境因子有关，如海拔、降雨量、温度和土壤等。研究结果表明文旦柚皮精油具有作为天然抗菌剂、功能性食品和保健类药物的潜力，可用于食品、化妆品和制药等行业，为推动我国柑橘属水果产业的绿色可持续发展提供了科学依据。