MMP-9在涎腺粘液表皮样癌中的表达及与其临床特征的相关性

顾起宏 刘胜文 杨雯君

涎腺粘液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)是临床最常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的30%，大多患者早期表现为无自觉症状，病灶生长相对缓慢[1-2]。该病可发生于任何年龄，以40～60岁为发病高峰[3-4]。其组织结构复杂、病理形态、分化程度不一与生物学行为存在不一致情况，导致患者的预后差异很大[5]。若能找到1种特异性和敏感性均较高的肿瘤标记物，将为临床诊治与预后评估提供可靠的参考依据[6-7]。基质金属蛋白酶-9(matrix metallo protein,MMP-9)家族又称明胶酶B(gelatinase B)，具有降解Ⅳ型胶原和明胶的功能[8]。当前研究显示MMP-9能够破坏基底膜的完整性，有利于肿瘤组织的侵袭和转移[9]。不过MMP-9对不同恶性肿瘤的影响还不一致，各学者间在判断某些因素是否影响临床特征与预后的标准还不明确[10-11]。本文具体探讨了MMP-9在涎腺粘液表皮样癌中的表达与临床特征的相关性。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

2016年2月到2018年1月，选择我院病理科收集的手术切除粘液表皮样癌标本共计50例(癌组织组)，其中手术切除的肿瘤边缘正常腺体组织50例(癌旁组，即组织距离肿瘤边缘大于5 mm)，观察组与对照组样本都来自同一批患者，纳入标准：粘液表皮样癌的诊断及病理分级依据2005年WHO的有关口腔组织病理学标准进行判断；临床、病理资料完整；年龄20～80岁；医院伦理委员会批准了此次研究；HE及免疫组化染色结果均经两位有经验的病理科医师双盲法阅片与协商取得结果。排除标准：临床、病理资料缺项者；妊娠与哺乳期妇女。

其中男性28例，女性22例；年龄27～78岁，平均年龄(45.69±3.38)岁，中位年龄(47.02±3.39)岁；肿瘤部位：腮腺27例，腭部13例，舌颊部10例；恶性程度：低度恶性5例，中度恶性10例，高度恶性35例；治疗方式：原发肿瘤扩大切除或者腮腺/颌下腺全切除；低度恶性、中度恶性不颈清，高度恶性颈清；放化疗指征：高度恶性，安全缘小于5 mm，颈淋巴结包膜外转移或转移数量多于1个；淋巴结转移4例，无淋巴结转移46例；肿瘤大小≥2 cm 10例，<2 cm 40例。

1.2 检测方法

所有标本均经10%福尔马林固定、石蜡包埋、4 μm连续切片。HE染色后进行免疫组化(S-P法)分析。兔抗人MMP-9单克隆抗体工作浓度为1∶200，购自北京中杉公司；二抗辣根酶标记抗兔IgG多克隆抗体，工作浓度1∶1000，购自北京中杉公司。

以阳性染色作为阳性对照，以PBS取代一抗作为阴性对照。选取经过HE染色验证的乳腺癌组织石蜡块，切出3 μm石蜡，将其放到载玻片上，以60 ℃的温度烤片4 h；两次二甲苯脱蜡，酒精梯度脱水后进行水洗；修复抗原，蒸馏水冲洗，5 min×3次；3% H2O2溶液处理15 min，PBS冲洗，5 min×3次；一抗4 ℃孵育12 h，PBS冲洗，5 min×3次；二抗25 ℃孵育30 min，PBS冲洗，5 min×3次；DAB室温下3～5 min显色，苏木精复染1～2 min细胞核，以梯度酒精脱水，以二甲苯透明，以中性树胶进行封片，镜下观察。

1.3 判定标准

MMP-9表达阳性率：随机选择具有代表性的10个高倍镜视野，以细胞膜/细胞质出现棕黄色颗粒沉着为阳性细胞，以视野下阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比和阳性细胞着色强度进行综合判定，无着色0分，着色淡1分，着色适中2分，着色深3分；阳性细胞占所观察细胞百分比≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50%为2分，>50%为3分，所着色强度与阳性细胞百分比得分相乘，<2分为(-)，2～3分为(弱阳性)，4～6分为(中阳性)，>6分为(强阳性)，弱阳性+中阳性+强阳性都判断为阳性。

MMP-9表达与临床特征的相关性：调查所有患者的性别、病案号、年龄、联系电话、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移情况等情况，分析在癌组织组中，MMP-9表达阳性与它们之间的相关性。

MMP-9表达阳性危险因素分析。

1.4 统计学处理

应用软件SPSS 20.00分析所得数据，计量数据与计数数据以均数±标准差、率等表示，计量数据的对比采用卡方(χ2)分析，影响因素分析用多因素非条件logistic回归分析，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 MMP-9表达阳性率对比

癌组织组中MMP-9表达阳性率为92.0%(46/50)，癌旁组为10.0%(5/50)，两组对比差异有统计学意义(χ2=67.267,P<0.05)。

2.2 MMP-9表达与其临床特征的相关性

在癌组织中，MMP-9表达阳性与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)，与性别、年龄、发病位置无相关性(P>0.05)，见表1。

表1 MMP-9在涎腺粘液表皮样癌中的表达与其临床特征的相关性(例，%)

2.3 影响因素分析

在癌组织中，以MMP-9表达阳性作为因变量，以调查的临床资料作为自变量，多因素非条件logistic回归分析显示：涎腺粘液表皮样癌的分化程度、淋巴结转移为影响MMP-9表达阳性的独立危险因素(OR=1.872，2.114，P<0.05)，见表2。

表2 影响涎腺粘液表皮样癌组织MMP-9表达阳性的多因素分析(n=50)

注：B为系数；SE为标准差。

3 讨论

涎腺粘液表皮样癌来源于涎腺导管上皮，是最常见的涎腺恶性肿瘤之一，约占涎腺恶性肿瘤的30%[12]。该病可见于任何年龄，发病高峰年龄为40～60岁，最小发病者可在1岁以下，男性与女性的发病率无显著差异[13]。根据涎腺粘液表皮样癌的癌细胞分化程度和生物学特点分析，该病进行高分化(低度恶性)、中分化(中度恶性)、低分化(高度恶性)等组织学分化，但是此种分化类型的判断主观性比较强，且费时费力，临床应用效果不佳[14]。

当前研究显示涎腺粘液表皮样癌的预后与肿瘤的临床特征密切相关，低分化型涎腺粘液表皮样癌的侵袭性强，转移率高。当前有学者也试图用生物学标记物来区分其恶性程度以获得更客观的评估[15]。MMP-9已成为当前恶性肿瘤研究中的1个热点，MMP-9能通过破坏基质降解平衡而促进癌细胞突破基底膜，从而侵袭周围组织和转移致远处组织。MMP-9也可以调控细胞间的相互支持，破坏原有的细胞间联系[16]。MMP-9存在于肿瘤细胞周围的基质细胞，并不是直接存在于肿瘤细胞内部[17]。本研究显示癌组织组中MMP-9表达阳性率为92.0%，癌旁组为10.0%，两组对比差异有统计学意义(P<0.05)。当前也有研究显示MMP-9可能改变基质环境，从而影响肿瘤的发展；而肿瘤细胞可以通过可溶性介质进行信息交换，协同产生和调节MMP-9，从而在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用[18]。

涎腺粘液表皮样癌是1种多因素参与、多步骤发展的疾病，也是由于正常涎腺组织细胞在其内在/外界致病因素长时间作用下，发生恶性变化而形成的。而细胞恶性转化的基础包括DNA损伤、基因突变等，细胞周期的失调、细胞增殖、相互诱导是其所依据的重要环节。肿瘤组织中可出现血管生成现象，可穿过新生有缺陷的血管内皮和基质膜进入血液循环，新生的血管为肿瘤组织细胞提供氧气和营养，是原位瘤生长和向远处扩散的基础[19]。本研究显示在癌组织组中，MMP-9表达阳性与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)，与性别、年龄、发病位置无相关性(P>0.05)；多因素非条件logistic回归分析显示涎腺粘液表皮样癌的分化程度、淋巴结转移为影响MMP-9表达阳性的独立危险因素(OR=1.872,2.114，P<0.05)。当前也有研究显示在血管形成和肿瘤转移过程中，MMP-9可上调内皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物的表达，有利于瘤细胞在血管内聚集及穿出瘤组织[20]。当前也有研究显示MMP-9由1个锌离子依赖性的蛋白酶家族组成，MMP-9在不同水平上均受严格的调节，MMP-9可以潜酶的形式分泌到细胞外，也可受到基质金属蛋白酶组织抑制剂的调节[21]；MMP-9参与涎腺肿瘤的浸润与转移，联合MMP-9抑制剂和抗血管生成药，有望成为将涎腺粘液表皮样癌的治疗新靶标[22]。不过本研究也有一定的不足，研究的样本量有限，MMP-9的作用具体机制还不明确，其与临床特征的相关性还有待于更进一步的验证。

总之，MMP-9在涎腺粘液表皮样癌中呈现高表达状况，与临床癌组织的分化程度、淋巴结转移显著相关。