琥珀酸高产菌株ASQ-1酱油发酵性能的初步研究

于江,于贞

(1.烟台大学 生命科学学院，山东 烟台 264005; 2.山东鲁花生物科技有限公司，山东 莱阳 265200)

米曲霉因为具有分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶和纤维素酶等酶的能力，成为酱油等调味品生产的主要菌株[1,2]，同时米曲霉也能分泌曲酸、琥珀酸等有机酸，从而对酱油的品质具有重要影响[3-5]。琥珀酸二钠目前作为国家承认的食品添加剂，已广泛应用于方便面海鲜汤料、肉制品、酱油、海鲜类等食品及其加工领域[6,7]。琥珀酸能提高酱油的鲜味，带来令人愉快的口感，而且琥珀酸不具有挥发性，能够长时间保持酱油的鲜味[8,9]。高端酱油的发展趋势是不添加任何防腐剂，而酱油中琥珀酸具有防腐功能，恰好满足了这一要求。成品酱油中添加琥珀酸不被消费者接受，如果是米曲霉在发酵过程中产生的，更容易被消费者接受。目前我国酱油酿造普遍采用米曲霉AS 3.042菌株或其诱变菌株，在酱油发酵过程中产生的琥珀酸浓度很低，成品酱油中的琥珀酸浓度根本达不到口味阈值[10]，因此需要对米曲霉孢子进行诱变，诱变的方法有很多，如紫外诱变和亚硝基胍诱变[11-14]，本文对米曲霉孢子的原生质体先进行紫外诱变再进行亚硝基胍诱变后得到高产琥珀酸的菌株ASQ-1，然后利用该菌株进行酱油的发酵，并对压榨酱油的各项理化指标进行检测，以期为该菌株的工业化应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验菌株：米曲霉AS3.042、米曲霉ASQ-1，烟台大学生物工程实验室保藏。

实验原料：豆粕、小麦粉，均由山东鲁花生物科技有限公司提供。

制曲设备：制曲设备和场地由山东鲁花生物科技有限公司提供。

1.2 主要实验仪器

K9860凯氏定氮仪、SH220石墨消解仪 济南海能仪器有限公司；GZX-9246MBE电热恒温干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.3 主要试剂

氢氧化钠、硝酸银、铬酸钾、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、盐酸、乙醇、甲基红、溴甲酚绿：均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 成曲制备

分别对米曲霉ASQ-1和AS3.042进行制曲。将豆粕和小麦粉干料按照6∶4进行混合，然后以豆粕润水量52%进行润水。利用蒸汽蒸煮30 min，冷却至40 ℃左右进行接种，接种量为3.3×106个/g。接种完毕后在32 ℃条件下培养89 h，在培养时间达到12 h和48 h时进行翻曲，达到培养时间后结束培养。

1.4.2 酱油发酵

酱油发酵采用高盐稀态发酵工艺。分别将米曲霉ASQ-1和AS3.042制备的成曲与盐水(NaCl含量22%)按照1∶2.2(质量体积比)比例混合，搅拌均匀后，置于30 L发酵罐中，在室温进行静态发酵，每种成曲3个重复。每隔15 d搅拌1次，发酵3个月后，取酱醪进行过滤，获得酱油原汁，对酱油原汁进行理化指标检测。

1.5 理化指标检测

琥珀酸的检测：高效液相色谱法[15,16]。

酿造酱油理化指标的检测：酿造酱油理化指标参照国标GB 18186-2000进行检测，包括可溶性无盐固形物、总酸、氨基酸态氮的检测。

pH的检测：利用pH计检测。

全氮和铵盐的检测：利用凯氏定氮仪检测。

2 结果与讨论

2.1 酱油原汁中琥珀酸含量对比

取发酵3个月的酱醪，过滤，检测其琥珀酸含量，以米曲霉AS3.042酱油原汁为对照，检测结果见图1。

图1 酱油原汁琥珀酸含量对比

由图1可知，ASQ-1酱油原汁中琥珀酸含量为0.488 g/L，对照酱油原汁中琥珀酸含量为0.075 g/L，ASQ-1菌株发酵生产的酱油中琥珀酸含量较对照高6.5倍。该结果证明ASQ-1应用到酱油发酵中能够大幅度提高酱油原汁中琥珀酸的含量。

2.2 酱油原汁中总酸和pH值对比

总酸和pH值是酱油质量的重要指标。取发酵3个月的酱油原汁，检测其总酸和pH值。ASQ-1发酵生产的酱油原汁和对照酱油原汁中总酸含量和pH值见图2。

图2 酱油原汁总酸含量和pH值对比

由图2可知，ASQ-1和对照的总酸含量和pH值均相差不大。诱变属于不可控制的筛选，由结果可知，应用ASQ-1发酵酱油不会对总酸和pH值造成影响。

2.3 酱油原汁中含氮化合物对比

取发酵3个月的酱油原汁，检测其全氮、铵盐和氨基酸态氮，结果见图3。

图3 酱油原汁含氮指标对比

由图3可知，采用菌株ASQ-1发酵生产的酱油原汁中的氨基酸态氮含量与对照相同，均为1.04 g/dL；ASQ-1发酵生产的酱油原汁中铵盐和全氮含量分别为0.21 g/dL和1.11 g/dL，对照酱油原汁中铵盐和全氮含量分别为0.27 g/dL和1.13 g/dL，ASQ-1酱油原汁中铵盐和全氮含量小于对照，其中ASQ-1酱油原汁中铵盐含量占全氮的18.92%，对照酱油原汁中铵盐含量占全氮的18.58%。铵盐含量越低，酱油质量越高，GB 18186-2000中规定铵盐含量应低于全氮含量的30%，ASQ-1菌株发酵的酱油原汁符合该标准。对照的酱油原汁中全氮含量高于ASQ-1酱油原汁，这可能是由于其铵盐含量较高。上述结果证明利用ASQ-1发酵的酱油原汁中氨基酸等含氮风味物质与其出发菌株相似，未造成不良影响。

2.4 酱油原汁中可溶性无盐固形物对比

酱油原汁中可溶性无盐固形物含量见图4。

图4 酱油原汁中可溶性无盐固形物含量对比

可溶性无盐固形物是酱油风味的另一重要指标，一般包含氨基酸、蛋白质、糖类和有机酸等。结果显示，ASQ-1酱油原汁中可溶性无盐固形物与对照值相差不大，分别为10.12 g/dL和10.1 g/dL。该结果说明ASQ-1发酵生产的酱油原汁除琥珀酸外整体风味物质的改变不大。

2.5 讨论

在ASQ-1诱变筛选的过程中，仅以琥珀酸含量的高低作为筛选指标，所以需要进行发酵实验来验证是否会出现负突变的现象。从ASQ-1发酵生产的酱油原汁与对照的理化指标结果来看，ASQ-1与对照相比，酱油原汁的主要风味物质指标如氨基酸态氮、总酸和可溶性无盐固形物均相同，而铵盐含量较对照有所降低，相应的全氮含量也偏低。从此结果来看，ASQ-1并未产生负突变，且利用其进行酱油发酵能够显著提高琥珀酸含量，提高酱油鲜味。除此之外，两者pH值同样，这为二者的相互比较提供了一个稳定的pH值环境。综合各项理化指标结果表明ASQ-1在提高酱油质量、提升酱油中琥珀酸含量方面具有极高的潜力，本研究为富产琥珀酸的米曲霉在工业上的应用提供了理论基础。

3 小结

利用ASQ-1作为菌种制备成曲，然后进行高盐稀态发酵，在发酵时间为3个月的酱油原汁中琥珀酸含量为0.488 g/L，是同等条件下对照的6.5倍。

利用ASQ-1发酵得到的酱油的理化指标与对照(米曲霉AS3.042)相似，其中总酸、pH和氨基酸态氮指标相同，可溶性无盐固形物含量相差不大，铵盐和全氮略低于对照。ASQ-1在提高酱油琥珀酸含量方面具有极高的潜力。