乳酸菌的代谢组学研究进展

吕铭守，林美君，陈凤莲，张光，石彦国

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150006)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一类革兰氏阳性、不产孢、不运动、过氧化氢酶试验呈阴性、耐氧且在缺少氧气的环境中生长良好的菌群，其发酵代谢的最终产物为乳酸[1]，在自然界中分布广泛。乳酸菌以益生菌形式在人体健康中起着至关重要的作用，是一种重要的工业微生物。乳酸菌及其代谢产物已广泛应用于食品、医药、饲料等领域[2,3]。在食品行业，乳酸菌有着极其广泛的应用，如发酵乳制品、肉类和蔬菜产品以及酒类的生产[4]。某种乳酸菌生产的抗生素或细菌素，在食品领域中已经被用作生物防腐剂[5]。随着科技的不断进步，乳酸菌在发酵、生物、食品等领域的应用和作用逐渐被人们注意到。因此，近年来，其相关领域的研究成为热门。

代谢组学(metabolomics)又称代谢物组学，其主要目标是识别、表征和量化包含生物体中存在的全部代谢物的代谢体，是对不同生物体内代谢物的综合分析，用于检测生物体整体水平代谢特征的组学技术，并通过代谢物组成来确定生物体系的系统生化谱和功能调控[6]。它的重点是定性和定量分析构成代谢体的初级和次级代谢产物等小分子量物质[7]。代谢组学主要研究“已经发生的生命过程”，是对蛋白质组学、基因组学和转录组学方法的补充，也是目前组学领域研究的热点之一[8,9]。因此，在代谢组学分析中代谢物数据库是必不可少的，常见的微生物代谢数据库有BioCyc Pathway、KEGG、NMD等。一些具有代表性的(微生物)代谢组学研究相关数据库及其功能见表1。

代谢组学的研究方法主要有靶向(targeted metabolomics)和非靶向(untargeted metabolomics)分析两种(见图1)[10]。靶向代谢组学旨在研究与假设生物学问题相关的潜在生物标记物或预选代谢物，是对特定目标代谢物的检测和分析，尤其是对单个或已知代谢途径的检测和分析。在敏感性、准确性和绝对定量指标方面具有显著优势。但有通量低、需采用分析标准品进行准确的定性定量分析的缺点。相反，非靶向涉及对所有内源性代谢物进行无偏向性的分析，具有通量高、操作简单等优势，但在敏感性、准确性和定量方面劣势明显，同时较依赖公共数据库，难以发现新物质。发展至今，代谢组学在系统医学、动物和植物研究、微生物等领域已得到广泛的应用[11-14]。

图1 代谢组学与代谢物组学及其分类研究内容

鉴于乳酸菌在与人类生活密切相关的重要领域都具有很高的应用价值，众多学者在乳酸菌相关研究中，已尝试使用代谢组学技术，并在菌种鉴定、研究代谢路径和代谢产物以及评价发酵食品等方面取得了一定的成果。本文就乳酸菌代谢组学的研究进展进行了综述，以期进一步推动代谢组学在乳酸菌研究领域的应用。

表1 (微生物)代谢组学研究相关数据库

1 代谢组学在乳酸菌分类和鉴定中的应用

传统的乳酸菌分类方法需要做大量的生理生化试验，且过程繁琐，结果不稳定[15]。随着分子生物学的飞速发展，基于基因型进行菌种分类的方法得到了广泛的应用，但是，由于基因复杂性，这类分类方法可能会产生一定的错误或者对遗传关系近的菌株的区分效果不好。而代谢物是细胞生命活动的终端产物，通常基因上的微小变化都会产生明显不同的代谢表型，所以利用代谢组学分析方法研究微生物代谢物谱的差异可以实现不同菌株的表型分类。

熊萍等[16]采用1H-NMR代谢组学方法研究了变异链球菌、血链球菌和嗜酸乳杆菌的胞外代谢产物，结果表明：代谢组学方法能够检测不同菌株的差别，在微生物鉴定中有良好的应用前景；Samelis等[17]采用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared, FTIR)方法获得了传统希腊Graviera奶酪中乳酸菌胞外代谢物的红外光谱图，通过与数据库比较实现了乳酸菌的鉴定；Yang等[18]将三重四极质谱仪(MS)与线性离子阱-轨道杂交质谱(MS)相结合，利用靶向和非靶向代谢组学技术，研究了它们在破译4个密切相关的乳杆菌/菌株中细微代谢差异方面的能力和性能。实验通过检测到的代谢物数量、变异系数(CV)分布、信号强度分布等进一步评价数据质量。在相同的生长条件下，所建立的平台最终被用于区分4种乳酸菌。

长期以来，人们认识到乳酸菌的生理生化鉴定的复杂和不确定性。现有的DNA-DNA杂交技术是一种费时费力的方法，甚至阻碍了我们对乳酸菌物种分类关系的认识。此外，乳酸菌种类间营养需求的相似性也妨碍了传统方法的鉴定。代谢组学方法分析速度快、灵敏度高、特异性强等优点使其在细菌检测和鉴定中的应用成为可能。此外，组合代谢组学方法在快速鉴别与人类健康密切相关的乳酸菌菌株方面具有巨大的潜力，在今后的研究中对它们在更复杂的细菌生长条件下的效用进行验证。

2 代谢组学在发酵工程中的应用

乳酸菌在不同的环境下会产生大量的代谢产物，主要是碳水化合物、挥发性的醇、酮、氨基酸、短链有机酸、长链脂肪酸和一些复杂的成分(抑菌物质、肽类等)，所以监测乳酸菌代谢过程中产物的变化尤为重要。

Suzanne等[19]采用综合二维气相色谱-飞行时间质谱代谢物谱分析方法(GC×GC-TOF/MS)，进行挥发性和非挥发性化合物的非目标检测，测定了布赫内氏乳杆菌LA1147厌氧发酵黄瓜腐烂以及自然微生物繁殖腐败过程中发生的变化。单因素方差分析与层次聚类分析相结合，发现92个代谢物在腐烂过程中发生了变化。大多数代谢物的变化先于乳酸的利用，表明乳酸不是发酵黄瓜厌氧腐坏菌的首选基质。研究检测乳酸利用前的生化变化的能力显示，瓜氨酸、海藻糖和纤维二糖作为化合物，在任何显著的产品降解之前，都可能表明布赫内氏乳杆菌菌株的代谢活性；Satoru等[20]采用核磁共振和固相微萃取-GC/MS两种代谢组学方法，对54个水溶性化合物和62个挥发性化合物进行了化学成分分析。此研究分析了日本Kiso地区以萝卜叶为原料生产的一种传统的无盐乳酸发酵泡菜Sunki的组成特征。主成分分析表明，根据农产品加工厂和生产年份的不同，样品具有不同的组成。这种差异是由于Sunki泡菜自发发酵过程中产生的乳酸细菌群落和萝卜叶初始营养成分的差异所致；Li等[21]通过氨基酸、胆汁、脂肪酸、葡萄糖等代谢途径，证实了植物乳杆菌NCU116对高脂血症大鼠的改善作用。他们采用超高效液相色谱-四极飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)的代谢组学方法，研究了植物乳杆菌NCU116对高脂饲料喂养高脂血症大鼠模型代谢产物的影响，鉴定了9种潜在的生物标志物(泛酸、5-羟基吲哚乙醛、甘胆酸、胆绿素IX、L-亮氨酸、2-苯乙醇葡萄糖醛酸、牛胆碱、吲哚丙烯酸和2-花生四烯醇甘油)，并利用质谱软件(MPP)分析了其途径特征。

发酵工艺的监控和优化需要检测大量的参数，利用代谢组学研究工具可以减少实验数量，提高检测通量，并有助于揭示发酵过程的生化网络机制，从而有利于理性优化工艺过程。此外，通过对代谢动力学的相关研究，可以掌握代谢途径以及代谢网络中的酶动力学关键参数，这对于关键参数的调控对代谢工程的优化将产生直接的促进作用。可见，代谢组学相关技术的发展和应用使系统分析或控制复杂的发酵过程成为可能。

3 代谢组学在评价发酵食品中的应用

许多发酵食品中既有营养成分又有非营养成分，它们具有调节人类健康的潜力。代谢组学在食品科学领域被用于监测原材料和最终产品的质量、加工、安全和微生物学，以提高消费者的健康和信心。世界上90%的天然发酵食品是在传统条件下发酵产生的[22]。根据原料的不同，利用特定、生态位适应的乳酸菌属和物种进行发酵，生产各种发酵食品和饮料，如酸奶、发酵乳、泡菜等。参与发酵的乳酸菌在发酵过程中起主导作用，能够提高发酵食品的营养价值[23]，同时，乳酸菌本身代谢也能产生核酸、腺苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤等，使其发酵的食品产生独特的风味[24]，基于以上乳酸菌的生物学特性，使其在食品发酵中被广泛应用。乳酸菌发酵食品的实例和所涉及的菌种见表2[25]。此外，在评定发酵食品的感官和营养品质方面，代谢组学也发挥着重要的作用。

表2 乳酸菌在发酵食品及饮料中的应用

续 表

Frank等[26]利用气相色谱/飞行时间质谱(ultrafast gas chromatography coupled to time of flight mass spectrometry,ultrafast GC/TOF-MS)联用仪构建挥发性风味物质的指纹图谱，同时采用气相色谱-质谱(GC-MS)的代谢组学方法研究个别乳酸菌菌株以及不同乳酸菌菌株组合对于发酵乳风味的影响；Sarn等[27]采用固相微萃取-气相色谱/质谱和1H-NMR辅助代谢组学方法，分别鉴定出37种挥发性代谢物和43种非挥发性代谢物。结果表明，鼠李乳杆菌GG和动物双歧杆菌BB-12均不影响乳酸的酸度和关键香气挥发性代谢产物。然而，在贮藏过程中，鼠李糖的存在对酸奶的非挥发性代谢物谱有一定的贡献；李汴生等[28]利用植物乳杆菌LP-115 400B对几种不同果蔬汁进行发酵，并通过静态-顶空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction,HS-SPME)和气质联用(GC-MS)分析各果蔬汁发酵前后挥发性风味和滋味物质的变化，同时结合定量描述分析(quantitative descriptive analysis, QDA)方法进行感官评价，探讨了乳酸菌发酵对果蔬汁风味感官品质产生的影响和适配性问题，结果表明，乳酸菌发酵代谢对不同果蔬汁风味影响差异较大。

利用发酵食品中代谢物谱的研究，观察发酵过程中代谢物的变化，以及预测发酵终产物感官和营养质量已经得到了广泛的应用。代谢组学可以作为一种重要的信息工具，适合于快速选择菌株/底物组合，并能够同时增加发酵食品的感官和健康促进特性。

4 代谢组学在评价乳酸菌益生效果方面的应用

近年来，益生菌的研究在全球范围内已经形成热潮，益生作用已被国际公认并不断发现新的功能[29]。乳酸菌是乳酸菌群的主要属，在人体中起着重要的作用。它们是重要的微生物群，可在许多人体部位被发现。许多乳酸菌种常被用作益生菌，在适当的剂量下可以有益于宿主的健康。近年来，乳酸菌对健康的作用持续受到了国内外研究者的广泛关注。

Hong等[30]采用1H-NMR和多元数据分析相结合的方法，对雄性小鼠粪便提取物进行代谢谱分析，评价益生菌对结肠炎症的影响。结果表明，益生菌不仅可以促进细胞因子表达，还可以提升血浆中部分短链脂肪酸、氨基酸、核苷酸、碳水化合物和乳酸含量；感染性乳腺炎是泌乳妇女的常见疾病，以葡萄球菌和链球菌为主要病因。在这方面，从母乳中分离出的一些乳酸菌株似乎对治疗乳腺炎有良好的效果，因此，是抗生素治疗的一种有吸引力的选择。基于核磁共振的代谢组学的应用使人们能够确定益生菌消费对患乳腺炎妇女的总体影响，并强调了这种方法在评估益生菌消耗成果方面的潜力。Rosa等[31]采用1H-NMR代谢组学方法，检测女性乳腺炎患者服用益生菌株(唾液乳杆菌PS2)后代谢组学差异。此外，Huynh等[32]研究了以半乳糖(GOS)和植物乳杆菌7-40菌株组成的饲粮共生体对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)免疫应答、免疫相关基因表达及对溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的抗药性的协同效应。采用1H-NMR代谢组学分析方法，对肝胰脏代谢产物进行了研究，并用反相高效液相色谱(RP-HPLC)和分光光度法对肝胰脏和血浆中的代谢产物进行了鉴定。

代谢组学是研究益生菌对宿主健康影响的有力工具。通过结合宿主蛋白质组学和基因组学的研究，可以提供有关益生菌对消费者健康影响的新信息。此外，代谢组学还可以提供有关使用益生菌株对健康受试者和患有不同疾病的人的代谢行为影响的信息。

5 代谢组学在乳酸菌代谢物淬灭和提取的研究进展

微生物代谢组学中没有关于微生物代谢活性瞬间淬灭、代谢物综合提取和相关代谢物分析的标准，因此细胞内代谢物的有效和可靠定量一直受到阻碍。虽然快速过滤法和微分法能有效地抑制代谢活性[33,34]，减少渗漏，但这些方法都是微生物特异性的[35]，无法防止代谢物的泄漏。因此，在制定精准定量细胞内代谢物的淬灭方案时，由于不同生物体细胞壁结构和膜组成的固有差异，人们不得不为每1种实验微生物确定最佳的淬灭或提取方法。

最常用的淬灭方法是在-40 ℃左右使用60%(V/V)的甲醇(MeOH)水溶液。该方法最初是针对酿酒酵母开发的[36]，并广泛应用于其他微生物，无需优化或验证。然而，在低温和高浓度MeOH引起冷冲击和严重泄漏后[37,38]，出现了较温和的淬灭方法，但各种方法的优缺点并未进行系统的对比。

Jensen等[39]提出了一种测定乳酸乳球菌胞内磷酸化糖浓度的实验方法。先将小体积的生长介质快速取样到60%(V/V)的甲醇中，预冷却到-35 ℃，使所有代谢活动迅速完全停止。而后氯仿在-25 ℃条件下进行液体-液体萃取，确保细胞膜对所需代谢物的总渗透性，以及可改变酶水平的失活。最后使用与磷酸化组分具有高度亲和力的柱进行固相萃取。但是实验过程中当乳酸乳球菌与冷甲醇接触时其代谢物就会从细胞中漏出，并存在于介质中和淬火后的生物质中；植物乳杆菌(L.plantarum)作为一种与人类密切相关的微生物，其代谢产物的研究却很少受到重视。Faijes等通过比较了4种不同的水淬液(均含60%甲醇)的效率，发现只有含有70 mmol/L HEPES或0.85%(W/V)碳酸铵(pH 5.5)的溶液可以显著地减少细胞内代谢物的渗漏。研究人员同时比较了冷甲醇、高氯酸、煮沸乙醇、氯仿/甲醇(1∶1)和氯仿/水(1∶1)的5种不同提取方法，并对具有代表性的细胞内代谢物进行定量测定，结果表明，冷甲醇、沸腾乙醇和高氯酸的提取效果最好；Yang等[40]采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，对乳发酵中常用的重要乳酸菌ZS2058的淬灭和提取工艺进行了评价。定量评价了8种不同浓度MeOH、乙醇Etoh、GOC和二甲基亚砜DMSO在不同温度下的淬灭方法，并分别用碘化丙啶(PI)和系统能荷(EC)法评价了它们对细胞膜完整性和代谢失活的影响。此外，对甲基特丁基醚(MTBE)/MeOH/水、乙腈(ACN)/水、ACN/MeOH/水等溶剂的萃取效率进行了评价。研究优化了植物ZS2058代谢物的分析方法，可为植物ZS2058代谢物特异性生物标志物的鉴定和代谢特性的分析提供依据。

乳酸菌代谢组学中关于乳酸菌代谢物的淬灭、提取方法和技术仅限于特定单一的菌株，且仅是能够将代谢物泄露降到最低，并不能从根本上解决泄露问题。同时，由于乳酸菌种中代谢物的复杂性，很难通过单一的方法对全部代谢物进行提取，因此未来的发展可以将多种组学技术和多种提取方法相结合进行深入研究。

6 展望

首先，微生物领域正在出现许多代谢组学数据库，但它们仅限于特定的微生物(酵母菌和大肠杆菌)。由于微生物代谢物的多样性和复杂性，目前关于许多微生物包括乳酸菌的标注代谢数据库目前还没有完善。

其次，哺乳动物的代谢途径似乎不能完全应用于微生物，因为哺乳动物中不存在许多微生物反应，例如次级代谢物的生物合成。由于现有的途径数据不能完全满足微生物代谢组学的需要，因此有必要为微生物识别建立特定的代谢途径和网络。

最后，目前的微生物代谢组学研究大多只关注代谢物，很少考虑代谢物的来源。例如，来自微生物和宿主的葡萄糖在化学上是相同的，但其生物学意义和导致它们差异调节的机制各不相同。因此，对微生物和宿主的代谢变化进行不同的研究，尤其是对微生物与宿主相互作用的研究具有重要意义。

总之，随着代谢组学技术的不断发展和完善，其在乳酸菌研究中将发挥更重要的作用。