商洛野生牛耳大黄中3种成分含量测定及影响因素研究

贾文江，李 春，曹望弟，刘喜玲，李 宏

（陕西省商洛市药品检验所，陕西 商洛 726000）

牛耳大黄为蓼科植物皱叶酸模Rumex crispusL.的根，又名四季菜根、火风棠、羊蹄根[1]，主要化学成分为大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等，有清热凉血、化痰止咳、通便杀虫功效，临床多用于治疗急性肝炎、慢性气管炎、吐血、血崩、血小板减少性紫癜、大便燥结、痢疾、疥癣、秃疮、疔、疖等。目前的牛耳大黄药材质量标准中仅有高效液相色谱（HPLC）法测定其中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量[2-3]。本研究中采用HPLC法同时测定并比较不同生长年限、不同生长时间商洛野生牛耳大黄中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的含量，为全面控制其质量奠定基础。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，包括紫外检测器（日本岛津公司）；SQP型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；AS30600BDT型超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

1.2 试药

大黄素对照品（批号为 110756-200110，含量98.0% ），大黄酚对照品（批号为 110796-201621，含量99.2%），大黄素甲醚对照品（批号为110758-200912，含量99.9%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

商洛野生牛耳大黄样品，经陕西省食品药品监督检验研究院郭耀武主任药师鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil 100-5 C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 -1% 冰醋酸溶液（75 ∶25，V／V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品各适量，精密称定，加甲醇溶解并定容，制成大黄素、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度分别为0.054，0.038，0.022 mg／mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品粉末（过4号筛）2 g，精密称定，置150 mL锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，20℃超声（功率250 W，频率50 kHz）处理30 min，冷却，以甲醇补足减失的质量，滤过，取续滤液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：取上述2种溶液各适量，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱，见图1。结果各相邻成分间分离度较好（R＞1.5），理论板数以大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰计均大于3 000。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察：取2.2项下混合对照品溶液，分别进样2，5，10，15，20 μL，测定，以对照品进样量（μg）为横坐标（X）、峰面积值为纵坐标（Y）进行线性回归，得回归方程，大黄素为Y1=38023X1+4828（r1=0.9999，n=5），大黄酚为Y2=55124X2-163146（r2=0.9995，n=5），大黄素甲醚为Y3=16 002X3+5 216.4（r3=0.998 3，n=5）。结果表明，大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的进样量分别在0.11～1.08 μg、0.08 ～ 0.76 μg、0.04 ～ 0.44 μg 范围内与峰面积值线性关系良好。

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液20 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，测定。结果大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.31%，0.45%，0.62%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2项下供试品溶液20 μL，室温下分别放置 0，2，4，8，12，18，24 h 时进样，按拟订色谱条件进样测定。结果大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的RSD分别为 0.17% ，0.10% ，0.07% （n=7），表明室温下供试品溶液在24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批样品粉末（过4号筛）6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量，结果的RSD分别为 0.82%，1.03%，1.18%（n=6），表明方法重复性较好。

加样回收试验：称取已知含量的同批次样品粉末（过4号筛）2.0 g，精密称定，平行6份，分别精密加入大黄素、大黄酚、大黄素甲醚质量浓度为0.1009，0.0992，0.050 0 g／L的混合对照品溶液各 3.0 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定峰面积，计算回收率。结果见表1。

2.4 样品含量测定

按拟订色谱条件，测定不同生长年限、不同保存时间样品的含量。结果见表2。

表1 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚加样回收试验结果（n=6）

表2 样品中3种成分含量测定结果（mg／g，n=3）

3 讨论

本研究中参考文献[4-18]，分别选取加甲醇25 mL 超声（功率 250 W，频率 50 kHz）15，30，45 min，发现超声30 min内样品提取最充分；同时分别在20℃（常温）与50℃条件下进行，结果含量无明显差异；同时考察了甲醇加热回流1 h、三氯甲烷超声提取、甲醇超声提取等方法，发现甲醇超声提取法快捷、简便、安全，故选择甲醇超声提取法。

流动相考察了甲醇与1%冰醋酸溶液不同比例（60∶40，75 ∶25，80∶20，V／V）的试验结果，发现样品和对照品在以甲醇-1%冰醋酸溶液（75∶25，V／V）为流动相时3个指标成分色谱峰分离度最好，理论板数最高，重复性最好，故本研究中采用甲醇-1%冰醋酸溶液（75∶25，V／V）为流动相。

比较不同生长年限样品含量结果，可见，1年生的上述3种成分含量最低，2年生的比多年生的含量稍偏低；同一多年生但保存时间为14个月与2个月的样品含量比较发现，大黄素含量减少，而大黄酚含量增加，大黄素甲醚含量基本不变，三者总含量变化不大。

综上所述，该方法简便、快捷，结果准确、可靠，可用于商洛野生牛耳大黄药材中大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量的同时测定。