紫花前胡素经Nox1／Akt信号通路对口腔鳞癌细胞增殖及侵袭的抑制作用

王 慧 ，邵义熊 ，阮自琴 ，毛 敏

（1.湖北省十堰市妇幼保健院口腔科，湖北 十堰 442000； 2.湖北医药学院附属太和医院口腔科，湖北 十堰 442000）

口腔鳞状细胞癌（简称口腔鳞癌）是常见的头颈部肿瘤，患者5年生存率仅为53%[1-2]。咀嚼槟榔、吸烟、饮酒等会持续产生氧化应激产物。过量的氧化应激产物产生会介导DNA损伤和／或脂质过氧化，这些均已被证实能加快口腔鳞癌的发展[3-4]。研究表明，口腔鳞癌患者唾液中的氧化应激标志物[如8-羟基-2′-脱氧鸟苷和丙二醛（MDA）]水平高于健康人群，而抗氧化剂维生素C和维生素 E水平则较低[5]。还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶（Nox／Duox）家族是产生氧化应激产物的酶家族，可在癌症的进程中发挥重要作用。上调Nox1表达和随后生成的氧化应激产物可促进癌细胞增殖[6-7]。紫花前胡素为紫花前胡的醇提物，有祛痰解痉、抗血小板聚集和抗炎作用，并可抑制癌细胞的生长和代谢[8-9]。本研究中探讨了紫花前胡素通过Nox1／Akt信号通路抑制口腔鳞癌细胞增殖及侵袭的作用，为口腔鳞癌的治疗提供参考。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与细胞

仪器：MilliCell室（美国 Millipore公司）；SpectraMax M5型分光光度计（美国MolecularDevices公司）；IX73型倒置显微镜（日本奥林巴斯公司）；FACSCantoⅡ型流式细胞仪（美国BD公司）；NanoDrop 2000型分光光度计（美国 Thermo Fisher Scientifc公司）；Applied Biosystems 7500型实时荧光定量聚合酶链反应系统（qPCR，美国Applied Biosystems公司）。

试药：10%胎牛血清（FBS），DMEM培养基，均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；四氮唑盐（MTT，德国Sigma-Aldrich 公司）；4′，6-二脒基 -2-苯基吲哚（DAPI），0.5% 结晶紫，均购自美国 Sigma 公司；Matrigel基质（美国BD公司）；RNA试剂盒、Ex Taq酶，均购自日本Takara公司。

细胞：口腔鳞癌SCC-25细胞，源自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。

1.2 方法

细胞培养及分组：SCC-25组（A组）及紫花前胡素低、中、高剂量组（B1组、B2组、B3组）取 10 mL SCC-25细胞（密度为5×106／mL）置有10%胎牛血清的DMEM培养基中，各组分别加入紫花前胡素 0，20.0，40.0，80.0μg／mL，置 CO2培养箱（37℃，5%CO2，2%O2，93%N2）。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

细胞增殖水平检测：采用四氮唑盐（MTT）比色法评估。取上述各组细胞，每孔中加入MTT溶液。孵育4 h后，加入裂解缓冲液（10%SDS 加入 0.01 mol／L HCl中）并孵育过夜。最后，使用分光光度计测定550 nm波长处的吸光度（OD），计算存活率及凋亡率。

细胞单克隆形成数目检测：取上述各组细胞，用胰蛋白酶处理，计数，并在密度为103细胞／孔的6孔板中用完全培养基重新接种8 d。每3 d更换培养基，以维持细胞生长。将菌落固定，并用0.5%结晶紫在室温下染色30 min。培养8 d后，在倒置显微镜下计数菌落数。

细胞体外侵袭试验：在MilliCell（直径12 mm，孔径8 μm）室上侧预涂Matrigel。在补充有0.1%血清的培养基中将1×105个上述各组细胞加入上部隔室中，并将该室置含有10%胎牛血清的培养基的24孔板中。在37℃下培养24 h后，擦去膜上侧的细胞，将下膜表面上的侵入细胞固定，并用DAPI染色。通过计数每个室10个高功率毡的穿膜孔数来量化侵入活动。

细胞凋亡水平：使用基于Annexin V（Axv）-FITC／PI双染色的流式细胞（FACS）分析。室温下在Axv-FITC和 PI（10 μg ／mL）中温育 15 min，使用流式细胞仪测定荧光强度。

细胞Nox1 RNA及P-Akt RNA表达水平：采用逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法测定。从上述各组细胞中提取总RNA。以分光光度计测定RNA浓度。确保浓度比值水平为 2.60～2.80，PCR 系统上用SYBR预混物Ex Taq进行qPCR。GAPDH mRNA用于标准化 RNA 比对。引物序列如下，Nox1（5′-GCAACCAATGGATCTCCTCCT-3′和 5′-GGGGAGAAAAACACCCCGAA-3′），P-Akt（5′-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3′和 5′-TCCGGGGACAGCATCAAATC-3′），GAPDH（5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′和 5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′）。热循环条件，40 个循环，在95℃下变性10s，在60℃下退火10s，在72℃下延伸15 s。数据用2-ΔΔCt法处理。平行测定3次。

细胞氧化应激水平：取上述各组细胞，5 000 r／min离心收集细胞，加入磷酸盐缓冲液（PBS）制成细胞悬液后，以酶联免疫吸附（ELISA）法测定培养液中超氧化物歧化酶（SOD）、MDA、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）蛋白水平。

1.3 统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表1至表4。

表1 各组SCC-25细胞OD值、存活率及凋亡率水平比较（n=6）

表2 各组SCC-25细胞克隆形成数目及穿膜数比较（n=6）

表3 各组SCC-25细胞Nox1及 P-Akt mRNA表达水平比较（n=6）

表4 各组SCC-25细胞氧化应激水平比较（n=3）

3 讨论

口腔鳞癌为常见恶性肿瘤，对放射治疗和化学疗法反应较差。紫花前胡素是一种天然的异丙基甲酚，具有镇痛、抗菌、抗炎、抗氧化和抗血管生成的作用[10]。肝癌细胞体外试验证实，紫花前胡素可通过一系列生物学途径抑制肝癌细胞的增殖，包括细胞周期调控、细胞凋亡、肿瘤发生、黏附和侵袭。此外，紫花前胡素对肺癌、乳腺癌和结肠癌细胞也具有一定抗增殖作用[11]。本研究结果显示，B1组、B2组、B3组的OD值、存活率、细胞克隆形成数目、穿膜数水平低于A组，凋亡率水平高于A组，这与上述文献结论相符合。同时提示，紫花前胡素能抑制口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭，并促进其凋亡。

Nox／Duox家族由7名成员组成，被认为是氧化应激产物生成的主要来源，其在癌症发生、发展中起重要作用[12]。据报道，对Nox1活性的抑制可诱导许多癌细胞（包括胰腺癌、间皮瘤和肉瘤）凋亡。RT-PCR分析显示，Nox1 mRNA和Nox4 mRNA在肺癌细胞系的重要亚组中呈高度表达[12]。基因敲除Nox1，可显著抑制肺癌细胞活力。Nox1还能抑制p53（K382）的乙酰化，后者是SiRT1脱乙酰酶的靶标，并抑制了p53促凋亡转录活性[13]。近期研究发现，在卵巢细胞癌中，Nox1的敲低显著增强了顺铂诱导的细胞凋亡。这一新发现提示了Nox1可能是癌细胞治疗的一个重要潜在靶点[14]。本研究结果显示，B1组、B2组、B3组的Nox1mRNA表达水平低于A组。说明紫花前胡素能抑制Nox1的表达，进而降低口腔鳞癌细胞的活性。

Akt是细胞存活的调节因子，通过其磷酸化活化抑制凋亡，从而防止细胞死亡和延长细胞存活期[15-16]。选择性抑制剂作用于磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K／Akt）对非小细胞肺癌、血液系统恶性肿瘤和头颈部鳞状细胞癌疗效较好[17]。本研究中发现，B1组、B2组、B3组的 Nox1 mRNA和P-Akt mRNA表达水平低于A组，提示紫花前胡素可通过抑制Nox1活性，降低Akt的磷酸化水平，进而加速口腔鳞癌细胞的凋亡。

由氧化应激产物水平分析结果可知，B1组、B2组、B3组的SOD和GSH-Px水平高于A组，MDA水平低于A组。提示紫花前胡素能明显降低氧化应激产物水平，进而抑制癌细胞的增殖及侵袭。这与上述文献的结果相符。

综上所述，紫花前胡素能抑制口腔鳞癌细胞增殖、侵袭，并促进其凋亡，其机制与紫花前胡素抑制Nox1活性并降低Akt的磷酸化水平，从而降低其氧化应激水平有关。但本研究中只探讨了紫花前胡素对Nox1 mRNA及Akt mRNA表达的影响，未探讨紫花前胡素对口腔鳞癌细胞Nox1／Akt信号通路上下游细胞因子表达的影响，这将在后续研究中进行。