富湾银矿的微生物多样性研究

高敬华 李楠 郭士杰 姜学霞

摘   要：本文主要是研究了富湾银矿微生物的多样性，通过采集富湾银矿土壤样品，利用16S rRNA基因序列分析细菌基因文库，通过系统进化分析确定了该矿区的微生物群落组成。结果表明，富湾银矿土壤的主要微生物群落包括变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和浮霉菌门（Planctomycetes）以及未分类的细菌类群，揭示了富湾银矿的土壤中存在着丰富的细菌，这为探讨微生物修复矿区土壤污染提供理论的基础。

关键词：矿区  多样性  16S rRNA  重金属污染

中图分类号：S154                                   文献标识码：A                        文章编号：1674-098X（2019）06（a）-0109-03

重金属污染积累性强，具有不可逆性。我国金属矿产资源丰厚，在矿山的开发、运送和矿石的冶炼过程中出现的尾矿、尾渣、粉尘颗粒等固液气体废弃物危害了矿区周围土壤和水体，给农业生产和周边环境良性发展造成潜在性危害[1]。重金属长期积累会危害人的智力发展以及身体发育[2]。 生物修复技术治理矿区重金属污染是关键技术，运用微生物的生化反应和代谢过程转化和治理矿区重金属污染，具备资金投入少、操作过程简单、没有产生二次污染等优点，是目前研究该领域的热点[3]。

广东富湾银矿位于广东省佛山市高明区富湾镇荷城街道东北部（华南褶皱系粤中凹陷内三洲上古生代断陷盆地的西北边缘），北北东向恩平一从化断裂带与东西向高要一惠来构造带交汇部位[4-5]，面积约 2.83km2。银矿比邻高明富湾大学城，周边村落居民群较多。高明矿产资源丰富，其中富湾银矿蕴藏量最大的金属矿之，富湾银矿曾因被拟定开采开发利用而引起公众关注。

本研究以富湾银矿已开采的地方土壤为研究对象进行样品采集，采用非培养的方法，直接提取土样中微生物的基因组DNA，通过PCR扩增、连接和转化构建了该矿区16S rRNA基因克隆文库，对矿区土壤细菌群落结构和多样性进行了研究，揭示了富湾银矿重金属污染与微生物之间的内在联系，为其他污染矿区土壤的微生物生态研究提供数据支撑。

1  材料与方法

1.1 样品采集

本研究选取广东省佛山市高明区富湾银矿区的土壤进行采集。地理坐标为：东径 112°48′01″，北纬 23°00′00″，根据矿区面积大小、地势情况和污染状况进行梅花形布点采样，采取0～15cm土层混合土样，四分法去掉多余土壤，装入无菌袋中，贴上标签，立即带回实验室。

1.2 富湾银矿细菌DNA提取

用强劲土壤DNA提取试剂盒提取菌种基因组的DNA，通用引物27F和1492R进行16S rRNA基因的PCR扩增，扩增产物用1%琼脂凝胶电泳检测。

1.3 测序与构建系统发育树

基因扩增产物纯化后送往上海美吉医药生物有限公司进行序列测定，共测定100条序列，将所得序列结果在GenBank数据库进行BLAST检索，同时下载与未知细菌同源性相对较高的序列，利用ClustalX比对分析， MEGA软件的N-J法构建系统发育树。确定样品中的细菌群落多样性，利用Microsoft Excel 2010绘制细菌组成分布情况。

2  结果

本次实验结果共计得到序列100条，发现这些序列可以分为6大门类（图2）：Proteobacteria（变形菌门）42%，其中Alphaproteobacteria（α-变形菌纲）21%、Betaproteobacteria（β-变形菌纲）6%、Gammaproteobacteria（γ-变形菌纲）15%，另外Clostridia（梭状芽胞杆菌纲）4%。Planctomycetes（浮霉菌门）5%、Actinobacteria（放线菌门）与Firmicutes（厚壁菌门）4%、Acidobacteria（酸杆菌门）12%、以及未知细菌37%左右。

3  讨论

环境中微生物的群落组成信息能反映出环境的特点，不同的细菌群落结构体现出他们特殊的生态功能。本研究对富湾银矿的研究结果进行了分析，把土壤细菌类群的多样性及各个类群所占的丰富度做了比较，发现Proteobacteria（变形菌门）是细菌中最大且多样性比较丰富的一个门，这与在云南省澜沧县募乃铅锌矿区尾矿中的研究结果一致[6]。有研究表明，变形菌是一种富营养菌，与土壤的养分呈正相关性[7]。因而变形菌更容易分解利用有机物，大量繁殖，形成优势菌种。在富湾银矿的土壤样品中发现α-变形菌优势菌群，占了21%，α-变形菌属于兼性厌氧光能营养型细菌[8]，是能广泛适应自然环境的菌种，具有适应生境的生理特性，特别是能在厌氧条件下反硝化脱氮，在水体、底泥、土壤等多种生境下存活。富湾银矿只是开采了一小部分，后被被制止开采，可能土壤的有机含量还是比较高，有半纤维素和蛋白质等简单有机物。本研究也发现γ-变形菌纲在微生物群落里也是属于主要的细菌类群，分析其原因是γ-变形杆菌适应能力强，在广泛分布于各种环境中;此外还存在有β-变形菌及伯克氏菌，β-变形菌也是厌氧异养型且能进行光合作用的细菌。据研究表明该菌群可降解烃类等，在比较缺乏氮的环境中具有固定氮[9]的作用，而且在高濃度的硝酸盐环境下具有反硝化能力，因而能够忍受高碱高盐的环境[10]。由此可以看出在环境恶劣矿区环境中，能够进行光合作用且能无机化能为自身细胞提供能量的细菌可以生活在矿区。