一株高产淀粉酶放线菌的筛选鉴定及产酶条件优化

2019-11-13 03:39袁春营孟阳吴佩佩
江苏农业科学 2019年17期
关键词:淀粉酶

袁春营 孟阳 吴佩佩

摘要:利用透明圈法和摇瓶发酵法从对虾养殖池塘底泥中筛选出1株淀粉酶高产菌株,扫描电子显微镜观察菌株的亚显微形态,生化方法测定了菌株的生理生化指标,分子生物学方法分析了菌株的16S rRNA序列,同时响应面法优化了该菌株的产酶条件。结果表明,根据菌株的亚显微形态、生理生化特征和16S rRNA序列比对,确定该菌株为卢森坦拟诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis);该菌株的最适产酶条件为初始pH值8.8、盐度60‰、温度40 ℃。筛选到的淀粉酶高产菌株,能够为工业生产提供耐盐碱淀粉酶储备菌株。

关键词:淀粉酶;卢森坦拟诺卡氏菌;亚星微形态;生理生化特征;RNA序列对比;产酶条件;响应法

中图分类号: S182  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)17-0288-04

淀粉酶是水解淀粉和糖原的一类酶的统称,其产量约占工业酶总产量的85%以上。淀粉酶在食品、焙烤、发酵、纺织、轻工业、畜牧业生产及医药产业中得到广泛应用[1-5]。但是在工業化生产中高盐、碱性等严苛条件制约着淀粉酶的应用。在此条件下,淀粉酶的稳定性下降,酶活力大幅度损失或者完全丧失,因此开发具有高稳定性的生物酶,使其能够适应高盐、碱性等工业环境,成为近年来亟待解决的重要难题。嗜盐细菌对外界自然环境的盐度具有极强的适应性,是一类重要的极端微生物资源。嗜盐菌可以在较高的盐度环境中生长,其最适盐浓度一般为0.5%~36.0%[6]。为了适应高盐度环境,这类细菌产生的各种酶往往具有一些独特的生物学特性,如耐盐、耐高或低pH值、耐碱等。因此,筛选高效耐盐碱淀粉酶产生菌株,并将其应用于工业化生产,具有重要的科学意义与实践价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验菌株从天津市汉沽南美白对虾养殖池塘底泥中筛选得到。

1.1.1 培养基 改良察氏培养基:NaNO3 3.00 g、K2HPO4 1.00 g、MgSO4 0.50 g、KCl 0.50 g、FeSO4 0.01 g、可溶性淀粉30.00 g、蒸馏水1.00 L,pH值7.2~7.4,固体培养基添加琼脂粉1.8%,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。改良LB培养基:蛋白胨10 g、NaCl 15 g、可溶性淀粉10 g、蒸馏水1 L,pH值 7.2~7.4,固体培养基添加琼脂粉1.8%,121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;化学试剂均为分析纯,购自北京索来宝生物科技有限公司。

1.1.2 试验仪器 立式双层小容量恒温培养摇床(上海新苗医疗器械制造有限公司);全温型多振幅轨道摇床(上海智城分析仪器制造有限公司); 立式蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);PCR扩增仪(美国伯乐公司);高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);精密pH计(天津市盛邦科学仪器技术开发有限公司);CO2培养箱(美国Thermo公司);电子分析天平[奥豪斯仪器(上海)有限公司]。

1.2 试验方法

1.2.1 淀粉酶产生菌株的筛选 取1 g池塘底泥,加入已灭菌的100 mL察氏培养基中,于30 ℃、120 r/min下恒温振荡富集培养,3 d后取5 mL培养液,转接至察氏培养基中,相同条件培养3 d。

无菌条件下对富集培养液进行梯度稀释,并在固体察氏培养基上进行涂布,30 ℃培养,3 d后在平板上滴数滴碘液,选取透明圈明显的菌株进行平板划线分离纯化。经过复筛,获得淀粉酶高产菌株,编号为EPM。

1.2.2 菌株的鉴定

1.2.2.1 菌株的形态学特征 菌株纯化后接种到察氏培养基中,30 ℃恒温培养3 d,革兰氏染色观察菌体的显微形态,扫描电镜下观察菌体的亚显微形态。

1.2.2.2 16S rRNA序列分析 试剂盒法提取细菌总DNA,16S rRNA通用引物(27F和1 495R)进行PCR扩增,反应体系(50 μL)为10×Buffer 5.0 μL;dNTPs 4.0 μL;27F 1.0 μL;1492R 1.0 μL;Taq酶0.5 μL;DNA模板2.0 μL;蒸馏水 36.5 μL。扩增程序为预变性94 ℃ 5 min;变性94 ℃ 30 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸1 min,30个循环;72 ℃维持10 min。

PCR产物送交北京奥科生物技术有限责任公司测序,所得序列提交GenBank数据库,并进行Blast分析比对。

1.2.3 淀粉酶活性的测定 3,5-二硝基水杨酸试剂显色法测定淀粉酶活性[7]。以0.1 μL粗酶液,1 min水解淀粉产生相当于1 μg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。

1.2.4 菌株EPM产酶条件优化 中心组合Box-Behnken优化试验,pH值、温度及盐度为自变量,以淀粉酶活性为响应值(Y),探讨3个因素对淀粉酶活性的影响,试验因素与设计见表1。

2 结果与分析

2.1 菌株EPM的筛选

从对虾养殖池塘底泥中筛选到透明圈直径较大的淀粉酶高产菌株EPM。由图1可知,此菌株产生的淀粉酶活性较高,菌株菌落为白色、不透明、圆形、边缘粗糙,生长过程中会产生抗生素药物的气味。

2.2 菌株EPM的鉴定

2.2.1 菌株的生理生化特征 菌株EPM的生理生化指标测定结果见表2。菌株EPM能够利用葡萄糖,不能利用乳糖,甲基红与靛基质试验为阴性,V-P试验为阳性,不产生硫化氢,不利用柠檬酸盐,可还原硝酸盐,能够形成菌膜,为革兰氏阳性菌。

2.2.2 菌株EPM的亚显微观察 由图2可知,扫描电镜下观察,菌株菌丝呈多层纤维状结构,菌丝宽度为0.5~1.0 μm,有些会断裂为短杆状。

2.2.3 菌株EPM的16S rRNA序列分析 用DNA纯化试剂盒对所提取的DNA进行纯化后,用16S rRNA通用引物进行PCR扩增,扩增产物的琼脂糖电泳图谱如图3所示。对PCR产物进行测序,将所得序列输入GenBank中,与NCBI中Microbial Nucleotide Blast进行比对,卢森坦拟诺卡氏菌(Nocardiopsis lucentensis)与此序列同源性最高,达99%。

结合以上EPM的菌落形态、菌株的亚显微形态、菌株的生理生化特征及16S rRNA序列分析,确定筛选到的菌株为卢森坦拟诺卡氏菌。

2.3 菌株的产酶条件优化

按照表1设计方案进行响应面试验,结果见表3。

采用Design expert 7.0软件对上述结果进行数据整理和分析,二次回归模型进行拟合,回归分析结果见表4、表5及表6。

P值小于0.05,表示该项指标显著,从表4可以看出,模型的P值小于0.05,说明该模型显著,一次项中A、B的P值均小于0.05,说明它们对响应值的影响显著,二次项中A2、B2、C2的P值均小于0.05,说明所选3个因素的二次项对响应值影响显著。表4的P值表明,在所选定的各因素水平范围内,对响应值的影响排序为温度>盐度>pH值。

回归模型中失拟项的P值大于0.05(表5),说明失拟项不显著,所选模型与实际情况拟合程度高,不需要引入更高次数的项,模型适当。

回归模型的复相关系数为0.960 3,校正相关系数为 0.889 0(表6),达到了较好水平,说明模型的预测值和实测值拟合较好,信噪比较大,说明这个模型能较好地反映试验结果。

最终拟合得到的二次回归方程为Y=1.350 0-0.160 0A-0.140 0B+0.005 7C-0.100 0AB-0.089 0AC-0.096 0BC-0.600 0A2-0.290 0B2-0.330 0C2。

由响应面回归分析和回归方程擬合,绘出响应面分析图,见图4至图6。

从图4可以看出,随着pH值和温度的升高,酶活性也随之增大,当pH值和温度升高到一定程度时,酶活性达到最大,pH值和温度继续升高时,酶活性又会随之下降,说明pH值和温度取某个适中值时,酶活性达到最大。同理,从图5、图6可以发现,pH值和盐度、温度和盐度同样对酶活性是非线性的,对酶活性同样存在二次项。通过软件优化、模拟得到最佳产酶条件为pH值8.8、温度39.19 ℃、盐度60.32‰,预测的淀粉酶活性为1.332 U/μL, 经3次验证试验, 实际测得淀粉酶活性为 1.356 U/μL。考虑到操作的便利,将培养条件修正为pH值 8.8、温度40 ℃、盐度60‰,在此条件下进行验证,实际测得淀粉酶活性为1.349 U/μL,验证试验和修正试验所得淀粉酶活性与理论值相差很小,说明采用响应面法优化得到的产酶条件参数准确可靠,模型具有较高的应用价值。

3 讨论

拟诺卡氏菌是一种重要的资源微生物。一些学者在拟诺卡氏菌资源收集、生态学及天然产物等方面开展了较多研究工作,探索了拟诺卡氏菌地理分布格局、适应极端环境机制,分离到多种化学结构丰富、活性新颖的新化合物,以及可降解淀粉、蛋白质、纤维素和木聚糖等生物大分子的具有耐冷、耐碱或耐热等特殊性质的酶[8-9]。笔者所在课题组从南美白对虾养殖池底泥中筛选到1株高产淀粉酶菌株,经过系列生理生化特征及16S rRNA序列分析,确定该菌株为卢森坦拟诺卡氏菌。

中度嗜盐菌因其具有较大的盐度适应性,并应用广泛,引起了人们的极大关注。1978年,Kushner对中度嗜盐菌定义为在0.5 mol/L(约3%)~2.5 mol/L(约15%)NaCl浓度之间有最佳生长的细菌[10]。1993年,Ramos-Cormenzana将中度嗜盐菌定义为在5%~20%盐度范围内能够最佳生长的细菌[11]。中度嗜盐菌在降解有毒化合物、环境污染治理等方面有重要的应用前景[12-13];中度嗜盐菌产生的酶如淀粉酶、核酸酶、蛋白酶等能够抑制某些植物病原真菌,还可用于实际生产生活中[14]。

本研究从对虾养殖池底泥中筛选到卢森坦拟诺卡氏菌,其淀粉酶活性达1 000 U/mL以上,高于芽孢杆菌属菌株产生的淀粉酶活性(293.8 U/mL)[15],后者的最适盐度为50‰,属于中度嗜盐菌。通过响应面法,笔者所在课题组优化了卢森坦拟诺卡氏菌的产酶条件,最适盐度为60‰,pH值为8.8,说明该菌株在盐度较高、碱度较大的环境中具有较好的淀粉酶产生能力,预示着该菌株在高盐高碱的环境中具有较大的应用前景,可应用于工业、食品和污水处理等方面。

参考文献:

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