含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌的高密度发酵和免疫效果

2019-11-13 03:39彭小兵杜吉革彭国瑞
江苏农业科学 2019年17期
关键词:荚膜产气梭菌

彭小兵 杜吉革 彭国瑞

摘要:为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21 d进行二免,分别测定一免、二免动物混合血清的中和效价。发酵结果显示,培养物菌体密度D600 nm达20.3,相对表达量为27.6%,D600 nm与相对表达量的乘积为摇瓶培养的6.5倍,菌体湿质量为37.2 g/L;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,目的蛋白以可溶形式表达。动物免疫效果评价结果显示,在家兔和绵羊上,抗原含量与免疫效果在一定的范围内均呈正相关,当接种量为300 μg/只时,免疫效果均最好;对腐败梭菌毒素与D型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价,在家兔上一免、二免分别达4与30、15与200,在绵羊上一免、二免分别达2与30、12与250。结果表明,DE3-pET-AE菌高密度发酵可获得高产量蛋白抗原,且抗原的免疫效果明显优于《中华人民共和国兽药典》合格标准。

关键词:腐败梭菌α毒素;产气荚膜梭菌ε毒素;大肠杆菌高密度发酵;免疫效果;抗原含量;家兔;綿羊

中图分类号:S852.4+3   文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)17-0186-03

羊快疫和肠毒血症是分别由腐败梭菌和D型产气荚膜梭菌引起绵羊和山羊发生急性死亡的2种重要梭菌性疾病[1],因发病急导致无法及时治疗,给养羊业造成重大损失,故免疫接种是预防该病的最有效途径。然而,国内现有用于预防该病的疫苗(如羊快疫、黑疫二联灭活疫苗与羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗及羊梭菌病多联干粉灭活疫苗等)的检验合格率并不高[2]。因此,一方面通过研制产毒培养基配方、改善发酵工艺进而提高抗原含量是提高传统疫苗免疫效果的有效途径之一;另一方面,通过基因工程方法研制亚单位疫苗也成为解决现有疫苗质量不高的另一重要候选途径。腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素分别是腐败梭菌和D型产气荚膜梭菌最主要的致死性毒力因子和保护性抗原,通过大肠杆菌表达系统分别获得这2种重组毒素蛋白,经制苗后免疫动物均可产生有效的免疫保护[3-5]。

鉴于此,本试验对已构建的同时含有腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌进行高密度发酵,以检测重组蛋白的生产效率。随后,将发酵产物制苗后免疫接种家兔和绵羊并检测血清中和效价,以评价发酵抗原的免疫效果,进而为研发亚单位疫苗积累数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌DE3-pET-AE,由笔者所在实验室构建并保存。

1.1.2 试验用动物 绵羊,5~6月龄,品种为小尾寒羊,购自河北保定满城区诚信养殖场。CD-1(ICR)小鼠,16~20 g,SPF(无特定病原)级;日本大耳白家兔,1.5~2.0 kg,清洁级。小鼠和家兔均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器 主要仪器有恒温摇床(培英,THZ-D型)、电子天平(METTLER TOLEDO,PB203-N型)、紫外分光光度计(SPECTRA max,384 plus)、台式高速冷冻离心机(KUBOTA,3500型)、生物反应器(Applicon,ez-control & 7 L Autoclavable Bioreactor)等。

1.1.4 主要试剂 腐败梭菌菌株C55-1株(CVCC60021)外毒素和D型产气荚膜梭菌C60-3株(CVCC82)外毒素,由笔者所在实验室制备并保存。α-乳糖,SIGMA公司;酪蛋白胨、酵母浸出物,北京奥博星生物技术有限公司;葡萄糖、无机盐、甘油,北京化学试剂公司;生理盐水、明胶缓冲液、葡萄糖溶液等参照《中国兽用生物制品规程》[6]配制。

1.2 方法

1.2.1 重组菌的复苏 将重组菌DE3-pET-AE划线接种于LB平板上[添加氨苄青霉素(简称Amp+)],37 ℃培养 12 h。

1.2.2 摇瓶振荡培养 挑取重组菌单菌落,接种于2 mL MDG[7](Amp+)非诱导培养基中,37 ℃、260 r/min振摇培养10 h;将全部培养物接种于100 mL ZYM-5052[7](Amp+)自诱导培养中,30 ℃、260 r/min振摇培养24 h。收获培养物,测定D600 nm,并进行蛋白电泳,用Quantity One软件分析靶蛋白的相对表达量。

1.2.3 生物反应器高密度发酵 挑取重组菌单菌落,接种于 4 mL MDG(Amp+)非诱导培养基中,37 ℃、260 r/min振摇培养16 h;将全部培养物接种于200 mL MDG(Amp+)非诱导培养基中,37 ℃、260 r/min振摇培养10 h。将培养物接种于含4 L基础培养基(Amp+)的生物反应器中进行发酵培养,接种量为4%,发酵温度为30 ℃,通气量为10 L/min,搅拌速度为500 r/min,控制pH值为7.0(补碱管接5 mol/L NaOH,补酸管接补料培养基),共培养24 h。在基础培养基中,C源组分用葡萄糖替换5052(即甘油、葡萄糖和乳糖的混合液),其他组分与ZYM-5052相同。补料培养基包括 10.0%酪蛋白胨、5.0%酵母浸出物、33.3%甘油、13.3%乳糖、0.8% MgSO4·7H2O。培养结束后收获培养物,测定D600 nm。对发酵后菌液进行10倍稀释,再经超声波裂解处理后对全菌、菌体破碎上清和包涵体进行蛋白质电泳,用Quantity One软件分析靶蛋白的相对表达量。

1.2.4 制苗 取生物反应器培养物,按总体积的0.4%加入甲醛溶液(含40%甲醛),37 ℃灭活48 h。经灭活脱毒检验合格后,以抗原、铝胶比例为4 ∶ 1来制备疫苗,使靶蛋白的终浓度为300 μg/mL。

1.2.5 疫苗在家兔上的免疫效果研究 免疫前在每只家兔耳中动脉采血5 mL,分离血清,按《中华人民共和国兽药典》[8]的方法测定血清对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD(最小致死量)数”。将疫苗用20%铝胶盐水(含200 g氢氧化铝胶和800 mL0.85%NaCl)稀释后,分别以300、150、75、37.5 μg的剂量皮下注射家兔各5只,免疫后21 d进行第2次免疫(免疫剂量及接种方式同首免),首免后21、35 d对每只家兔进行耳中动脉采血5 mL,分离血清,测定每组5只家兔混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。

1.2.6 疫苗在绵羊上的免疫效果研究 免疫前在每只绵羊颈静脉采血5 mL,分离血清,按《中华人民共和国兽药典》[8]的方法测定血清对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。将疫苗用20%铝胶盐水稀释后,分别以300、150、75、37.5 μg的剂量皮下注射绵羊各5只,免疫后21 d进行第2次免疫(免疫剂量及接种方式同首免),首免后21、35 d 对每只绵羊进行颈静脉采血5 mL,分离血清,測定每组5只绵羊混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。

2 结果与分析

2.1 摇瓶振荡培养结果

采用摇瓶振荡培养重组大肠杆菌DE3-pET-AE,30 ℃、260 r/min培养24 h,结果菌体密度D600 nm为4.81,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后用软件测算得到目的蛋白相对表达量为17.9%,C值(C=D600 nm×相对表达量)为0.86。

2.2 高密度发酵结果

采用生物反应器高密度发酵重组大肠杆菌DE3-pET-AE,30 ℃培养24 h,结果菌体密度D600 nm达20.3,相对表达量为27.6%,C值为5.60,菌体湿质量为37.2 g/L。SDS-PAGE结果见图1,可见目的蛋白以可溶形式表达。

2.3 疫苗在家兔上的免疫效果

对免疫前家兔血清进行测定,结果对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价均小于1,均为抗体阴性兔。将不同抗原剂量的疫苗分别免疫家兔后,测定每组5只家兔混合血清对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。由表1可知,在一定范围内抗原剂量与免疫效果呈正相关;一免、二免血清中和效价均达到或显著高于《中华人民共和国兽药典》相关产品合格的标准(即血清中和效价对腐败梭菌毒素应达到1 MLOs/0.1 mL,对D型产气荚膜梭菌毒素应达到3 MLOs/0.1 mL)[8]。对于腐败梭菌毒素组分,一免血清效价为《中华人民共和国兽药典》合格标准的 1~4倍,二免血清效价大幅提高为《中华人民共和国兽药典》合格标准的3~15倍,增至一免效价的2~5倍。对于D型产气荚膜梭菌毒素组分,一免血清效价为《中华人民共和国兽药典》合格标准的10倍,二免血清效价大幅提高为《中华人民共和国兽药典》合格标准的17~67倍,增至一免效价的 1.7~6.7倍。提示免疫剂量为300 μg/只时,家兔免疫效果最好,一免血清效价对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别可达到《中华人民共和国兽药典》合格标准的4、10倍,而二免效价则分别可达到《中华人民共和国兽药典》合格标准的15、67倍。

2.4 疫苗在绵羊上的免疫效果

对免疫前绵羊血清进行测定,结果对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价均小于1,均为抗体阴性绵羊。将不同抗原剂量的疫苗分别免疫绵羊后,测定每组5只绵羊混合血清分别对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素的中和效价。由表2可知,在一定范围内抗原剂量与免疫效果呈正相关;一免、二免血清中和效价均达到或显著高于《中华人民共和国兽药典》相关产品合格的标准(即血清中和效价对腐败梭菌毒素应达到1 MLDs/0.1 mL,对D型产气荚膜梭菌毒素应达到3 MLDs/0.1 mL)[8]。对于腐败梭菌毒素组分,一免血清效价为《中华人民共和国兽药典》合格标准的 1~4倍,二免血清效价大幅提高为《中华人民共和国兽药典》合格标准的2~12倍,增至一免效价的2~6倍。对于D型产气荚膜梭菌毒素组分,一免血清效价为《中华人民共和国兽药典》合格标准的1.7~10.0倍,二免血清效价大幅提高为《中华人民共和国兽药典》合格标准的16.7~83.3倍,增至一免效价的5~10倍。提示免疫剂量为300 μg/只时,绵羊免疫效果最好,一免血清效价对腐败梭菌毒素和D型产气荚膜梭菌毒素分别可达到《中华人民共和国兽药典》合格标准的2、6倍,而二免效价则分别可达到《中华人民共和国兽药典》标准的12、83.3倍。

3 讨论

自诱导培养基的原理在于碳源,即大肠杆菌优先使用葡萄糖生长至饱和,当葡萄糖被消耗殆尽时开始使用乳糖(既作为碳源,又作为诱导剂),进而表达目的蛋白[7]。自诱导系统的优点在于重组菌可生长至较高密度,无需人为添加诱导剂,并且用乳糖替代异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)具有无毒且价廉的特点。本研究用自诱导系统进行摇瓶培养,菌体密度D600 nm达到4.81时,远高于以LB培养至D560 nm为0.5~1.0再加入IPTG诱导的培养方式。影响重组大肠杆菌高密度发酵的主要因素包括宿主菌、接种量、培养基成分、培养方式、培养条件、诱导剂的选择、补料方式等[9-10]。本研究在借鉴前人经验和自诱导原理的基础上,采用生物反应器进行高密度发酵,即先以葡萄糖作为碳源使细菌生长到高密度,再以流加含甘油和乳糖组合的方式诱导目的蛋白表达,结果菌体密度D600 nm达到摇瓶培养的4.2倍,相对表达量达到摇瓶培养的1.5倍,菌体密度和相对表达量的乘积达到摇瓶培养的6.5倍。本研究所采用的高密度发酵策略使重组蛋白产率大大提高,并且其后的动物试验也证明发酵产物具有良好的免疫效果,此策略可供其他研究者借鉴参考。另外,本研究的发酵产物以可溶性形式表达,将有利于蛋白折叠成天然构象进而露出抗原表位,可能有助于抗原获得可靠的免疫效果。

本研究首次报道了同时含有腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因重组大肠杆菌的高密度发酵工艺,及其产物在家兔和绵羊上的免疫效果。同时表达2种毒素蛋白的优势在于仅发酵1株大肠杆菌即可达到预防2种疾病的目的。家兔和绵羊试验结果也表明,重组蛋白免疫效果良好,其诱发机体产生的较好的血清中和效价显著高于现有《中华人民共和国兽药典》合格标准[8],即使低至“每只动物予37.5 μg”的抗原免疫量仍可达到标准。笔者曾报道现有疫苗检验合格率不高[2],并且田间绵羊效价检测合格率也偏低(数据未报道)。由此推知,靶动物免疫持续期的抗体效价将更难达到合格标准。值得一提的是,国际上羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症类疫苗无论在田间使用还是在替代动物效力检验[11-12]上均采用2次免疫。故本研究对二免家兔和绵羊的血清效价均进行了评估,结果显示2种组分的二免效价均获得大幅增长,分别提升为《中华人民共和国兽药典》合格标准的至少12倍和67倍,此结果为我国此类疫病的防控及制品质量评价标准与方法的改进提供了参考依据。综合一免、二免数据来看,家兔和绵羊获得最佳效价的抗原剂量相同,且各剂量的家兔效果普遍好于绵羊,推测其原因可能是绵羊体质量相对较大,故需要接种的抗原量更多。

随着基因工程技术的日益成熟,亚单位疫苗的发展速度也越来越快,本研究结果为羊快疫和肠毒血症的预防提供了基础性数据。此外,国内外常将不同的梭菌组分相互联合或与其他非梭菌组分相联合制备多联苗,以达到“一针多防”的目的[8,11-12]。本研究所制备的发酵产物经动物试验表明,可用于同时预防羊快疫和肠毒血症,至于将其进一步联合其他组分制备更多联疫苗的可行性及组分间的兼容性,仍有待于进一步研究验证。

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