猴头菇液体菌种中杂菌的分离鉴定及变化规律

张楠 李鑫 唐宗福

摘要：为掌握猴头菇液体制种过程中主要感染杂菌的种类及变化规律，以采取有效的措施降低染菌率，分析猴头菇活化菌种保存时间与种子液染菌率的关系，鉴定种子液中感染杂菌的种类和来源，评价6种抗生素对杂菌的抑制作用。结果表明，猴头菇活化菌种在温度为4 ℃条件下，于0～5 d时间段内接种于液体培养基时染菌率最低，均在20%左右，随着时间的延长，染菌率呈上升趋势。感染种子液的杂菌有5种（分别命名为WR1、WR2、WR3、WR4、WR5），其中4种为芽孢杆菌和1种为葡萄球菌，主要来源于进行试验场所的空气中，它们对硫酸庆大霉素和乳酸链球菌素较为敏感。综上所述，要解决猴头菇液体制种过程中染菌的问题，首先是严格规范试验操作，其次是减少活化菌种保存时间，最后是保持实验室空气清洁。必要时在种子培养基中可以加入一定量的乳酸链球菌素，以减少染菌率。

关键词：猴头菇;液体菌种;杂菌;分离鉴定;杂菌的来源;最小抑/杀菌浓度;变化规律

中图分类号： S646.904  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）17-0157-05

猴头菇（Hericium erinaceus），因其形状酷似猴子头而得名，别称猴头菌、猴头蘑、刺猬菌等，是一种重要的药食两用菌[1]。它含有多肽、多糖、酰胺、甾体化合物、萜类化合物、酚类化合物、生物碱类化合物和吡喃酮类化合物等，具有抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化、抗炎症、抗疲劳、增强免疫力、保护肝脾、降血糖、降血脂等功效[2-3]，对神经衰退及老年痴呆等神经性疾病有较好的治疗效果。这些良好的生理功效正日益受到人们的关注和重视，许多猴头菇相关的食品和保健品得以開发利用，猴头菇市场需求不断扩大，猴头菇产品的主要生产原料主要来自猴头菇成熟的子实体和通过发酵产生的菌丝体[4]，猴头菇子实体和菌丝体的获得均需要大量的猴头菇菌种，菌种生产是首道工序，其直接关系到猴头菇产量与品质，是生产成败的关键[5]。

猴头菇菌种的生产方式主要有2种，一种是传统的固体菌种，另一种是液体菌种，与固体菌种相比，液体菌种具有很多优越性[6]。首先，液体菌种没有级别之分，既可以作为母种接种到原种培养基中，也可以作为栽培种直接接种到栽培袋中，既简化了生产工艺，又降低生产成本;其次，液体菌种在完全无菌条件下制得，菌种纯度高，菌龄一致;再次，液体菌种萌发速度快，可降低污染率;最后，液体菌种操作简便，生产周期短、易于工业化生产[7-8]。目前，液体菌种的制备多采用“（斜面）母种→一级摇瓶种→二级摇瓶种→培养器”的生产工艺[9-10]，其中由斜面母种制备一级摇瓶种这一环节最容易出现感染杂菌的现象，这一环节染菌可最终导致培养器染菌。染杂菌的发生主要是由母种带菌（感染了杂菌）造成的，食用菌母种在转接或保存过程中最容易感染细菌（这种现象很难用肉眼去发现），往往造成食用菌的一级摇瓶种和二级摇瓶种染菌，这也是食用菌产业合作社和食用菌种植户在栽培过程中不采用液体菌种的主要原因。

前人将染菌预防措施的研究重点放在加强环境卫生管理、选用纯度高和菌丝健壮的菌种等方面，并未对液体菌种易感染的杂菌种类、来源及相关规律进行探究[7]。因此，本研究分离和鉴定猴头菇液体菌种易感染的细菌，并分析它们的来源，探讨杂菌感染率与活化的斜面母种（从沙土管和液体石蜡保存的菌种）保存时间的变化规律，还提出了相应的防治措施。目的是为了帮助食用菌专业合作社或者食用菌种植户能采取防治液体菌种染菌的措施，预防或减少猴头菇液体菌种制备过程中染菌的发生，从而加快猴头菇液体菌种的应用和推广。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 猴头菇TJH-03分离自四川省唐家河国家级自然保护区的猴头菇鲜标本。

1.1.2 培养基 猴头菇菌株活化培养基为改良PDA培养基[11]，猴头菇液体种子液培养基为改良PDA液体培养基，猴头菇液体菌种中感染的杂菌分离培养基为LB固体培养基。

1.1.3 抗生素 硫酸庆大霉素（效价≥590 μg/mg）、硫酸卡那霉素〔效价（无水）≥750 μg/mg〕、氨苄青霉素钠（效价 845～988 μg/mg）和硫酸链霉素（效价650～850 μg/mg）均为USP级（美国药典标准），均购于美国Amresco公司。乳酸链球菌素（nisin）为食品级，购于石家庄春信生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化 用直径为10 mm的无菌打孔器在培养好的猴头菇TJH-03平板上打取长势一致的菌饼，用灭菌小镊子挑取打好的菌片接种到PDA平板中央上（培养基体积为15 mL），每皿放1片菌，于温度为25 ℃条件下倒置培养5～7 d，得到TJH-03活化菌种，用封口膜密封保存备用。

1.2.2 不同保存时间对种子液染菌率的影响 将活化的TJH-03菌种保存于20 ℃恒温培养箱和4 ℃冰箱中。在保存0、1、5、10、15、20 d同一条件下取8个平板，接种于种子液培养基（50 mL/500 mL三角瓶）中，每瓶取4片菌饼，接种50瓶，在25 ℃温度条件下120 r/min培养7 d，计算染菌率。每天观察种子液的状态变化，在培养的过程中如果种子液出现浑浊的现象，说明它们感染了杂菌。每组试验重复3次，数据以平均数表示。

1.2.3 种子液中杂菌的分离与纯化 采用稀释平板涂布法对猴头菇感染杂菌的种子液中的细菌进行分离[12]，在无菌条件下取10 mL种子液加到装有90 mL灭菌生理盐水的三角瓶中，充分振荡混匀，静置15 min，再以无菌生理盐水进行10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取3个连续梯度的稀释液各0.2 mL涂布于LB固体培养基上，37 ℃条件下倒置培养24～36 h待培养皿长出菌落，根据形态、颜色等挑选典型菌落在LB固体培养基上划线纯化，重复3～4次，直至出现单菌落，将纯化后的单菌株接入LB培养基中扩大培养并保存菌种。

1.2.4 杂菌的分类鉴定 通过形态、生理生化特性并结合16S rRNA基因序列对种子液中感染的杂菌进行分类鉴定。形态特征采用革兰氏染色观察法，生理生化鉴定参照东秀珠等《常见细菌系统鉴定手册》上的方法[13]进行测定。

16S rDNA鉴定：用TaKaRa miniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取菌株DNA，具体步骤参见试剂说明书，用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）引物扩增16S rDNA，所用试剂为TaKaRa PCR Amplification Kit，PCR步驟和程序采用吴晓晖等的方法[14]。PCR扩增产物送于生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因序列测定。将基因序列在NCBI的BLAST检索系统中进行序列同源性分析，并使用MEGA 6.0软件对基因序列进行系统发育分析和进化树的构建。

1.2.5 杂菌的来源分析 参照GB/T 16294—2010《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》[15]对进行猴头菇液体菌种相关试验场所（主要包括接种室、超净工作台、培养室、保存室、冰箱）环境中的微生物进行收集，采样结束后于TSA平板32 ℃培养箱中倒置培养3 d[16]。根据形态、颜色等挑选平板中典型菌落，划线纯化，通过形态、生理生化特性并结合16S rRNA基因序列进行分类鉴定，并与WR1、WR2、WR3、WR4、WR5进行同源性分析。

1.2.6 最小抑/杀菌浓度的测定 取无菌96微孔板，第1孔加入150 μL的MH肉汤培养基（不含抗生素）作为阴性对照，第2孔至第11孔分别加入75 μL的MH肉汤培养基2倍稀释各抗生素溶液，使各孔最终质量浓度分别为2 000.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.95 μg/mL[17-18]。第2孔至第12孔分别加入1×106 CFU/mL 细菌悬液75 μL，第12孔再加入75 μL的MH肉汤培养基作为阳性对照，将微孔板置于37 ℃培养箱中恒温培养24 h，观察各孔的变化。最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，简称MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，简称MBC）测定参照美国临床试验标准委员会（clinical and laboratory standards institute，简称NCCLS）的第25版信息增刊M100-S25文件[19]。以菌株WR1、WR2、WR3、WR4和WR5为指试菌，测定硫酸庆大霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、乳酸链球菌素和硫酸链霉素对它们的MIC和MBC。

1.2.7 数据统计处理 所有试验重复3次，检测数据以“平均数±标准差”表示，用SAS 9.4软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同保存温度及时间对种子液染菌率的影响

由表1可知，在4 ℃条件下冷藏和在20 ℃恒温条件下，染菌率的变化趋势较为一致，均随着保存时间的延长，染菌率逐渐上升，4 ℃温度条件下染菌率从16.00%升到45.33%;在20 ℃温度条件下，染菌率从18.00%升到46.00%。在1～5 d的时间段出现了平稳区域，染菌率差异不显著（P>0.05），均在20%左右;而在5～15 d时染菌率显著上升，5、10、15 d染菌率的差异极显著。

2.2 种子液中杂菌的分离与鉴定

从感染细菌种子液中共分离纯化得到5种菌株，分别记为WR1、WR2、WR3、WR4、WR5。随着菌种保存时间的延长，在接种时不但导致染菌率的增加，同时还导致感染细菌种类的增加（表2）。菌种在保存0、1 d接种时，从感染的种子液中分离纯化得到2种菌株，即WR1、WR2;在保存 5 d 时，WR1、WR2、WR5被分离纯化得到;在保存10 d时，分离纯化得到菌株在WR1、WR2、WR5的基础上增加了WR4;在保存15、20 d时，5种菌株全部被分离纯化得到。

参考《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》[13，20]，结合表2、表3的试验结果，初步确定菌株WR1、WR2、WR4、WR5分别与蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、阿耶波多氏芽孢杆菌（B. aryabhattai）、贝莱斯芽孢杆菌（B. aryabhattai）鉴定特征接近，菌株WR3与Staphylococcus petrasii鉴定特征相接近[21-22]。

将5株细菌16S rRNA序列通过BLAST软件与GenBank数据库进行同源性比对分析，选取同源性较高的模式菌株，通过MEGA 6.06软件采用Neighbour-Joining法构建系统发育树（图1、图2），并用DNAMAN 8.0软件计算序列的相似性。结果表明，菌株WR1与蜡样芽孢杆菌ATCC 14579（NR_074540.1）高度相近，相似性高达99.86%;菌株WR2与枯草芽孢杆菌JCM 1465（NR_113265.1）相似性高达100.00%;菌株WR3与S. petrasii CCM 8418（NR_118450.1）高度相近，相似性高达100.00%;菌株WR4与阿耶波多氏芽孢杆菌B8W22（NR_115953.1）高度相近，相似性高达99.65%;菌株WR5与贝莱斯芽孢杆菌FZB42（NR_075005.2）高度相近，相似性高达99.86%。结合形态特征及生理生化鉴定结果，最终将菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5分别鉴定为蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、S. petrasii、阿耶波多氏芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌。

2.3 杂菌的来源分析

将WR1、WR2、WR3、WR4、WR5与相关试验场所内的微生物进行对比，结果（表4）发现，WR1、WR2、WR4和WR5均存在于接种室、 培养室、保存室和冰箱中，说明猴头菇液体菌种在制备过程中污染的杂菌主要来自于进行试验的场所内。从杂菌来源来看，严格规范试验操作是减少污染最主要的途径，减少实验室的内空气流动也十分必要[23]。此外，WR3还未找到来源，须进一步研究。

2.4 最小抑/杀菌浓度的测定

由表5可知，硫酸庆大霉素和乳酸链球菌对菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5均具有较好抑菌效果，硫酸庆大霉素对菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MIC分別为31-25、31.25、62.50、31.25、31.25 μg/mL，乳酸链球菌对菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MIC分别为250.00、500-00、125-00、125.00、500.00 μg/mL。取MIC以上无细菌生长的清亮管中100 μL培养液涂布肉汤固体培养基平板上，进行活菌计数，37 ℃恒温条件下培养12 h，观察有无细菌生长。平板上细菌计数少于5个菌落者的最低浓度为MBC。因此，确定硫酸庆大霉素对菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MBC分别为250.00、125.00、500.00、500.00、125.00 μg/mL，乳酸链球菌素对菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MBC分别为1 000.00、1 000.00、500.00、250.00、1 000.00 μg/mL。

3 结论与讨论

食用菌液体菌种是指采用液体深层培养法获得的菌种[24]，是在发酵罐中采用液体培养基通入无菌空气并加以搅拌，以增加培养基中的溶氧量，控制发酵工艺参数，给菌丝生长提供一个最佳的营养、酸碱度、温度、供氧量，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间内获得大量菌种。液体菌种在香菇[9]、草菇[25]、双孢蘑菇[26]、杏鲍菇[27]、金针菇[28]的生产和栽培上得到应用，并表现出制种周期短、接种效率高、定植封面快、发菌周期短、菌龄一致以及污染率和生产成本低等优点，适合食用菌规模化、工厂化生产。

食用菌液体制种技术不同于传统的固体制种技术，生产环节较多，易引起杂菌感染菌种，使食用菌商品率降低，经济效益下降。研究发现，造成猴头菇液体菌种污染的主要原因是专用母种带菌，即专用种在制作过程中造成污染或者是在存贮过程中造成二次污染，这就要求活化好的猴头菇菌种应在0～1 d内进行液体培养基接种，最长不超过5 d，不仅可以降低染菌概率，还可以保持菌种良好活性。从感染杂菌的种类看，主要是芽孢杆菌（WR1、WR2、WR4、WR5）和葡萄球菌（WR3），其中WR1和WR2为主要感染菌。此外，WR1、WR2、WR4和WR5主要存在于微生物接种室、培养室、保存室和冰箱中，说明猴头菇液体菌种染菌可能是研究人员在微生物研究过程中操作不当引起的污染。因此，液体菌种栽培对操作人员要求更高，生产中要严格实行操作技术规程，具有较强的无菌意识，同时要对菌种制备室进行定期有效的消毒，消除杂菌。

最小抑/杀菌浓度的测定结果显示，硫酸庆大霉素和乳酸链球菌素对菌株WR1、WR2、WR3、WR4和WR5的抑菌效果佳，因此，在试验允许的前提下可以在培养基中加一定量的抗生素，可优先选择乳酸链球菌素。乳酸链球菌素是由乳酸链球菌产生的一种新型多肽，对许多革兰氏阳性菌具有强烈的抑制作用，摄入后可被人体中的蛋白酶降解为各种氨基酸，没有毒副作用，因此它是目前世界上唯一允许使用在食品防腐方面的抗菌素[18，29]。乳酸链球菌素耐酸、耐热性能优良，在酸性条件下高温灭菌时仍呈现稳定性[30]，而猴头菇菌丝适宜在酸性环境下生长，一般要求pH值在4.5～6.5[31]，这样就可以在液体种子培养基中加入乳酸链球菌素，与培养基一起高温灭菌，冷却到适宜的温度后，接入菌种即可。这也为猴头菇菌液体深层发酵和猴头菇菌丝体的应用提供了技术支持，用液体发酵法生产的猴头菇菌丝体要比栽培生产子实体简便、快速，并且通过发酵生产的猴头菇菌丝体的营养成分无论是蛋白质、氨基酸含量还是维生素含量均类似于子实体，用液体发酵菌丝体可以制备食用菌饮料、调味品、食品添加剂及饲料添加剂等[32]，开发利用猴头菇液体发酵获得菌丝体及其代谢产物来制备药物具有较好的发展前景。

本研究表明，在猴头菇液体菌种制备过程中，活化菌种应在0 d内进行接种，最长不要超过5 d，既能保持菌种的活性，又能降低染菌率。感染液体菌种的主要杂菌是蜡样芽孢杆菌（B. cereus）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis），其次是S. petrasii、阿耶波多氏芽孢杆菌（B. aryabhattai）和贝莱斯芽孢杆菌（B. aryabhattai）。防治猴头菇液体菌种污染的有效措施是严格规范试验操作、减少菌种保存时间和保持实验室空气清洁。乳酸链球菌素作为唯一被允许用作食品添加剂的细菌素，不仅能够减少猴头菇液体菌种和菌丝体发酵的染菌率，还能够满足食品安全要求。

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