食品中检测志贺氏菌的实时荧光RPA方法的建立与应用

刘立兵 孙晓霞 姜彦芬 王金凤 陈志敏 王建昌

（石家庄海关技术中心 石家庄 050051）

食源性疾病目前是全世界关注的重要公共卫生问题，无论在发达国家还是发展中国家，每年都会有数千万的人因感染食源性致病菌而发病，严重者导致死亡[1]。志贺氏菌（Shigella）作为主要的食源性致病菌之一，在我国引起感染性腹泻的致病菌中居首位。志贺氏菌属由4种革兰氏阴性、非运动性、无芽孢形成的杆状细菌组成，分别是鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌[2-3]。毒力较强的志贺氏菌可以引起人类细菌性痢疾，表现出轻度痢疾、发热、腹部绞痛以及严重的体液流失[4-5]。

传统的志贺氏菌检测主要依赖于细菌培养及一系列的生化鉴定，检测周期较长，无法实现快速检测。目前的分子生物学检测方法可以有效克服传统检测方法的部分劣势而被多数研究者所青睐，其中重组酶聚合酶扩增技术因其特异性强，灵敏性高，反应时间短，操作简便等优点而受到广泛关注，具有巨大的发展前景。RPA技术是在3种核心酶的作用下进行核酸的等温扩增。其中，重组酶与特异性引物结合后形成复合物，可移动寻找同源的双链DNA，随后发生链置换。单链DNA结合蛋白与同源DNA结合，引物与互补的DNA链结合，在链置换DNA聚合酶作用下延伸[6]。RPA基本原理是模仿体内核酸复制机制[7]，利用酶打开模板链，不需要反复热变性，在常温条件下（25～42°C）即可实现对核酸的扩增。RPA技术在检测时间上具有明显的优势，一般5～20 min内即可判定结果[8]。如果在反应中加入特异性引物探针[9]，通过荧光检测设备就可实现对目的片段扩增的实时监控。

本研究以志贺氏菌高度保守的侵袭性质粒抗原H基因（ipaH）为靶基因，建立了用于食品中志贺氏菌快速检测的real-time RPA方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与设备

志贺氏菌增菌肉汤、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂等细菌培养基，北京陆桥技术有限责任公司；TransStart Probe qPCR SuperMix（2×），全式金生物技术有限公司；荧光型RAA检测试剂盒，杭州众测生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，宝生物工程有限公司；引物及探针由通用生物工程股份有限公司合成。

Genie III等温扩增荧光检测系统，英国Opti-Gene公司；Step One Plus Real-time PCR System，美国ABI应用生物公司；核酸蛋白分析仪（PS232C），赛默飞世尔生物技术有限公司。

1.2 菌株

本试验所用的菌株见表1。

表1 本研究所用菌种Table1 Bacterial strains used in the study

1.3 细菌基因组DNA的提取

将宋内氏志贺氏菌（CICC21679）纯培养菌接种于10 mL营养肉汤中，36℃培养18 h。取菌液1 mL加入1.5 mL Eppendorf管中，10 000 r/min离心1 min，收集沉淀。按照细菌基因组DNA提取说明提取志贺氏菌DNA，置于-20℃保存备用。同时使用核酸蛋白分析仪测定基因组DNA的浓度。

1.4 引物探针的设计与合成

参考GeneBank中志贺氏菌ipaH基因保守区域（登录号：AE005674），设计扩增大小为247 bp片段的引物和探针（见表2）。

1.5 实时荧光 RPA方法的建立

50 μL 反应体系：RPA-F/R（10 μmol/L）各 2 μL，exo Probe（10 μmol/L）0.6 μL，A Buffer 12.5 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 29.4 μL。 将上述 47.5 μL体系混匀后加入到装有冻干酶制剂（1 mmol/L dNTP，90 ng/μL 单链结合蛋白，120 ng/μL recA 重组酶，30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶，30 ng/μL Exo核酸外切酶，100 mmol/L Tricine，20%PEG，5 mmol/L二硫苏糖醇，100 ng/μL肌酸激酶）的反应管中，在管盖上加入2.5 μL B Buffer，盖上管盖瞬时离心10 s，并涡旋后放入Genie III中。

表2 引物和探针序列Table2 Sequence of primers and probes

反应条件：39℃恒温反应20 min。

1.6 实时荧光 PCR方法

按照文献[10]中的反应体系和反应条件进行。反应体系：TransStart Probe qPCR SuperMix（2×）12.5 μL，PCR-F/R（10 μmol/L）各 1.5 μL，探针（5 μmol/L）0.9 μL，DNA 1 μL，补水至 25 μL。 将上述体系充分混匀后放入Step One Plus Real-time PCR System中。

反应条件：95℃预变性40 s；95℃变性10 s，60℃延伸35 s，35个循环，60℃收集荧光信号。

1.7 特异性和灵敏性试验

根据1.5节建立的实时荧光RPA方法对表1中所有细菌DNA进行检测，根据扩增曲线验证该引物探针的特异性。

以10倍稀释的志贺氏菌DNA进行实时荧光RPA方法的灵敏性检测，根据不同浓度扩增曲线确定该方法的灵敏性，同时与文献中的实时荧光PCR方法进行比较。

1.8 人工污染样品检测

将过夜培养的宋内氏志贺氏菌（CICC21679）菌液进行倍比稀释，选取可计数范围内的3个稀释度菌液均匀地涂在木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂板上，每个稀释度做3个平行，用于计算志贺氏菌的初始浓度。称取25 g西兰花和25 g鸡肉样品中（样品预先按照GB4789.5-2012检测，均未检出志贺氏菌），加入到225 mL志贺氏菌增菌肉汤中，添加 1～10，10～50，50～100 CFU 细菌，36℃增菌培养6，8 h后，采用荧光RPA和实时荧光PCR方法进行检测。

2 结果与分析

2.1 特异性试验

以志贺氏菌和其它细菌DNA作为模板进行荧光RPA检测，结果表明，仅志贺氏菌呈现典型的扩增曲线，其它细菌均无扩增，说明本研究建立的荧光RPA检测方法具有较强的特异性（表1）。

2.2 灵敏性试验

经核酸蛋白分析仪测定志贺氏菌菌液DNA质量浓度为35 ng/μL，将其稀释至 3.5×10-5ng/μL，以不同质量浓度的基因组DNA为模板进行荧光RPA和实时荧光PCR反应。结果表明，3.5×10-3ng/μL菌液质量浓度为荧光RPA方法的最低检出限，与实时荧光PCR方法检出限一致（图1），说明本研究建立的荧光RPA方法具有很好的灵敏性。

2.3 人工污染样品的检测结果

通过荧光RPA方法对志贺氏菌增菌液培养后的西兰花、鸡肉样品进行检测。结果表明，3个梯度菌液质量浓度的污染量在增菌时间为8 h时，两种样品中的志贺氏菌均可检出；当样品污染量为46 CFU/25 g、增菌时间为6 h时，鸡肉样品中志贺氏菌可检出，而西兰花样品中未能检出；当样品污染量为101 CFU/25 g、增菌时间为6 h时，两种样品中的贺氏菌均可检出。两种方法对所有样品的检测结果一致，而real-time RPA仅需要7～12 min，而real-time PCR则需要35 min以上（Ct值为27～34之间）（表3）。

图1 志贺氏菌荧光 RPA和实时荧光PCR检出限分析Fig.1 The detection limit analysis of Shigella with real-time RPA and real-time PCR

表3 荧光RPA和实时荧光PCR方法检测人工污染样品Table3 Detection of artificial contamination samples by real-time RPA and real-time PCR

3 讨论

志贺氏菌主要造成人的急性侵袭性肠道感染[11]，会对人类健康造成严重威胁，是一种重要的食源性致病菌。本文以志贺氏菌ipaH基因为靶基因，建立了一种可以有效检测志贺氏菌的realtime RPA方法。该方法特异性强，灵敏度高，在39℃恒温下仅需要20 min即可完成检测。

目前已建立了多种志贺氏菌的检测方法。常规的检验程序需要增菌，选择性平板分离培养，生化试验，血清学分离鉴定等，耗时长，操作繁琐，难以满足大批量样品检测或突发公共卫生事件处理的需求[12]。在分子生物学检测方面，常用的方法包括聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增法（LAMP）和基因芯片技术等[13]。PCR反应由变性、退火、延伸3个基本步骤构成，反应完成后进行电泳检测，必要时需要对产物进行纯化或测序分析，一般需要经验丰富的技术人员进行操作，且PCR设配昂贵。LAMP扩增目的片段时依赖于一种具有链置换特性的DNA聚合酶和4～6条能够识别靶序列6个特异区域的引物[14]，引物设计较为繁琐，其扩增产物经电泳检测呈梯度条带，不易与非特异性条带区分[15]。与上述方法相比，本研究中建立的real-time RPA方法具有如下优势：（1）操作简便，仅需增菌提取核酸后即可上机检测，所有试剂均以冻干粉的形式保存在反应管中；（2）反应时间短，不需要热变性，20 min内即可完成；（3）反应结果可直接观察，无需电泳检测；（4）便携式荧光检测设备的使用。本研究中使用的Genie III等温扩增荧光检测系统体积小，便于携带，触摸式操作系统，结果观察直观，内置锂电池可持续工作20 h，可用于微生物性食品中毒事件引起的现场检测[16-18]。

本研究中运用建立的real-time RPA方法，对人工污染志贺氏菌的不同样品进行检测，当样品污染量为46 CFU/25 g、增菌6 h时，鸡肉中可检出志贺氏菌，西兰花中未能检出。在细菌污染量、增菌时间相同的情况下，鸡肉中志贺氏菌检出所需要的时间均小于西兰花样品，这可能由于不同基质提取核酸的效率不同，或是不同介质中细菌繁殖数量有差异导致。本研究中real-time RPA和real-time PCR检测结果一致，然而前者检测所需时间明显短于后者。

本研究建立针对志贺氏菌的real-time RPA方法特异性强，灵敏性高，操作简单，反应时间短，可以实现对食品样品中志贺氏菌的有效检测，并可以用于现场检测，为食品和食源性公共卫生事件中的志贺氏菌的检测提供了一种新方法。