LC-Q-TOF-MS高分辨质谱法测定保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物

丁 博 王志元 陈文锐 谢建军 曾广丰

（1 广州医科大学药学院 广州 511436

2 广州海关技术中心 广州 510623）

随着经济发展和人们健康意识的提高，食用保健食品来调节和改善人体功能成为更多人的选择，保健食品行业也随之迅速发展起来。截至2017年，我国批准的保健食品共16 632种，其中国产保健食品15 880种，进口保健食品752种[1]。2014年国内保健品销售总额已达到1 858亿元，预计到2020年医药大健行业更会达到惊人的8万亿元，中国保健食品行业呈现高速发展的趋势[2]。作为最具有投资价值的行业之一，保健品行业的监管体系仍未完善，企业素质参差不齐，保健食品检出违禁药物的事件屡有报道[3-4]。保健食品不以预防、治疗疾病为目的。在各种保健食品中，调节血糖类、减肥类、抗疲劳类、增强免疫力类、改善睡眠类、降血压类等功能保健食品的非法药物添加问题比较严重。目前保健食品中非法添加药品的总体状况有以下4个特点[5]：（1）添加物来源不明；（2）非法添加药物剂量随意；（3）非法添加药物的兼容性不明确；（4）药物复合添加。2008年，南京市食品药品监督局曝光119种壮阳类的保健品违法添加西地那非类药物[6]。2015年11月国家食品药品监督管理总局在市场上查获31种假冒并涉嫌违法添加药物成分的保健食品，其中检出二甲双胍、苯乙双胍、格列苯脲、罗格列酮、西布曲明、西地那非、酚酞等违禁药物[5]。国家食品药品监督管理局在2012年发布了《关于发布保健食品中可能非法添加的物质名单（第一批）的通知》[7]，列出了6类保健品中可能添加的47种违禁药物，然而这远不能涵盖所有可能的非法添加物质。由此可见，迫切需要建立保健食品中高通量违禁药物筛查检测方法。

QuEChERS最早由Anastassiades等[8]报道用来检测蔬菜与水果中农药残留，作为一种快速高效地前处理技术被广泛应用于食品农药残留检测分析领域[9-11]。近年来，文献报道采用QuEChERS技术提取分离大豆中异黄酮类化合物[12-13]，以及保健食品中违禁药物的检测[14-15]。文献报道一些抗风湿、哮喘及解热镇痛类中成药物中非法添加抗炎、镇静安神类西药成分[16-17]。由此推测，声称提高免疫力功能的保健食品可能非法添加此类药物成分。本文研究对比分析溶剂提取法与QuEChERS前处理法提取保健食品中违禁药物成分，依据IDA-MS技术获得目标物的高分辨质谱信息，建立LC-Q-TOF-MS高分辨质谱法检测保健食品中抗炎、镇静安神类违禁药物。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠、无水硫酸镁（AR），广州化学试剂厂；甲醇、乙腈（HPLC纯），美国赛默飞世尔科技ThermoFisher Scientific公司；试验所用水由德国默克公司的Milli-Q Advantage A10超纯水系统提供。标准品：醋酸可的松（Hydrocortisone acetate）、醋酸氢化可的松（Cortisone acetate）、醋酸泼尼松（Prednisone 21-acetate）、醋酸氢化泼尼松（Prednisolone acetate）、甲泼尼龙（Methylprednisolone）、氯氟美松（Clobetasol propionate）、曲安奈德（Triamcinolone acetonide）、醋酸氟轻松（Fluocinonide）、甲氧苄啶（Trimethoprim）、新诺明（Sulfamethoxazole）、安替比林（Antipyrine）、酮洛芬（Ketoprofen）、萘普生（Naproxen）、吲哚美辛（Indometacin）、哌唑嗪（Prazosin）、吡罗昔康（Piroxicam）、瑞格列奈（Repaglinide）、地塞米松（Dexamethasone）、阿普唑仑（Alprazolam）、氯硝西泮（Clonazepam）、地西泮（Diazepam）、劳拉西泮（Lorazepam）、硝西泮（Nitrazepam）、奥沙西泮（Oxazepam），德国Dr Ehrestorfor公司，纯度大于98%。16个食品样品购买于广州某超市。

1.2 仪器与设备

TripleTOFTM5600高分辨质谱仪，美国AB SCIEX公司；岛津LC-20AD液相色谱系统，日本岛津公司；Sartorius BT223S电子天平、Sartorius CPA225D 电子天平，德国Sartorius公司；Milli-Q Advantage A10超纯水系统，法国Merck Millipore公司；Sonoswiss SW30H超声波清洗机、Transferpette 单道数字可调移液器（20～200 μL，200～1000 μL），德国 Brand公司。

1.3 分析方法

1.3.1 标准溶液配制 精确称量5.00～10.00 mg抗炎镇痛、镇静安神类标准品，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，得到单一标准母液。再根据计算结果，各取一定量母液至一个10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，摇匀。得到25 mg/L的混合标准储备溶液，甲醇稀释 10，25，50，100，200 μg/L和400 μg/L混合标准工作溶液。

1.3.2 仪器分析条件 色谱柱：XBridge BEH C18 XP 色谱柱（2.5 μm，4.6 mm×100 mm），流动相：A-0.1%甲酸，B-乙腈，梯度洗脱，初始 30%B，3 min升至40%，4 min升至70%，8 min升至80%，9 min升至100%，11 min保持100%，11.5 min降至30%，保持至13 min结束；流速0.5 mL/min；柱温：40℃；进样量 1 μL。

质谱条件：离子源：ESI和APCI复合源；扫描方式：正离子；APCI源：连接ABsciex公司自动校正系统（CDS），每15个样品自动校正1次，校正液流速0.35 mL/min；气帘气：40 psi，雾化气：50 psi，辅助气：50 psi；离子源温度：500 ℃；离子源电压：5 500 V；一级TOF-MS扫描准确质量范围：100～1 000 u；数据采集时间：100 ms；DP：100 V；CE：10 V；二级IDA-MS扫描准确质量范围：50～1 000 u；DP：100 V；CE：（35±15）V；高灵敏模式；数据采集时间：50 ms；信号阈值：100 cps；IDA 实验每循环采集6次数据，动态背景减法扣除。

所有质谱数据由ABSciex公司的Analyst TF 1.6软件采集，数据在PeakView 2.0和MultiQuant 3.0软件上进行分析。使用峰面积进行定量。

1.3.3 样品前处理 QuEChERS法：片剂、冲剂、丸剂粉碎后混匀，胶囊剪开取内容物，称取0.500 g于50 mL聚丙烯离心管中，与0.25 g氯化钠和1 g硫酸镁混合，再加入净化剂，然后加入15 mL 70%乙腈水溶液，摇匀，超声处理15 min后以10 000 r/min，5 min离心，将上清液转移至25 mL具塞刻度试管，用70%乙腈定容至刻度线，摇匀，取约1 mL过0.22 μm有机滤膜待测。本试验选取空白（不加净化剂）、50 mg C18、50 mg GCB、25 mg C18+25 mg GCB作为净化剂，探究净化剂对提取率的影响。

溶剂提取法：冲剂、丸剂粉碎后混匀，胶囊剪开取内容物，称取0.500 g样品于50 mL聚丙烯离心管中，分别加入15 mL提取溶剂，超声处理15 min。10 000 r/min，5 min离心后将上清液转移至25 mL具塞刻度试管，用相应提取溶剂定容至刻度线，摇匀。取定容后的溶液约1 mL过0.22 μm有机滤膜待测。本试验选取80%甲醇-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%甲醇-水溶液、80%乙腈-水溶液、50 mmol/L甲酸-80%乙腈-水溶液为提取溶剂，探究不同提取溶剂对目标物提取的影响。

表1 定性定量分析质谱数据Table1 Mass fragmentation patterns of anti-inflammatory and sedative drugs

2 结果与分析

2.1 高分辨质谱定性定量分析依据

利用IDA-MS高分辨质谱技术检测分析保健食品样品中非法添加24种抗炎、镇静安神类违禁药物，目标违禁药物一级母离子的精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子的精确质量数和理论质量与测得质量误差等信息见表1。

2.2 超声辅助溶剂提取

参考研究报道利用甲醇、乙腈、酸化甲醇和酸化乙腈等溶剂提取复杂食品样品基质中目标分析物[18]，本试验选择80%甲醇、80%甲醇与50 mmol/L甲酸、80%乙腈和80%乙腈与50 mmol/L甲酸4种溶剂提取保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物成分，选择固体药片和鱼油胶囊两种样品作为基质考察对象（图1），违禁药物加标质量浓度是 50 μg/L。

由图1a可知，4种溶剂对固体药片基质样品中违禁药物提取回收率差异不显著，除了哌唑嗪之外，其它23种违禁药物回收率均在80%以上。图1b显示4种溶剂提取方式对油状胶囊样品基质中违禁药物提取回收率差异显著，80%乙腈与50 mmol/L甲酸溶剂提取回收率明显高于其它3种溶剂，另外，油胶囊样品基质中哌唑嗪提取回收率也低于80%。结合两种样品基质回收率考察结果，试验选择80%乙腈与50 mmol/L甲酸溶剂提取保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物，并与QuEChERS前处理方法进行对比试验。

图1 溶剂萃取不同样品基质中违禁药物的回收率Fig.1 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with solvent extraction in the different matrix samples

2.3 QuEChERS前处理

选择固体药片和油状胶囊两种样品考察QuEChERS萃取违禁药物的回收率情况，选择C18、GCB等不同类型净化剂，试验结果见图2。在无净化剂、C18、GCB、GCB 与 C18等条件 QuEChERS前处理法提取固体药片基质保健食品中违禁药物的回收率差异不显著，其中甲泼尼龙（Methylprednisolone），氯氟美松（Clobetasol propionate）违禁药物的回收率较低（图2a）；油状胶囊基质保健食品样品中违禁药物在不同净化剂条件下的回收率较为显著，其中在C18净化剂条件下，醋酸氢化可的松（Cortisone acetate），醋酸氢化泼尼松（Prednisolone acetate），甲泼尼龙（Methylprednisolone），氯氟美松（Clobetasol propionate），曲安奈德（Triamcinolone acetonide），醋酸 氟 轻 松（Fluocinonide），甲氧苄啶（Trimethoprim），新诺明（Sulfamethoxazole），安替比林（Antipyrine），酮洛芬（Ketoprofen），吲哚美辛（Indometacin），哌唑嗪（Prazosin），吡罗昔康（Piroxicam），瑞格列奈（Repaglinide），阿普唑仑（Alprazolam），氯硝西泮（Clonazepam），地西泮（Diazepam），劳拉西泮（Lorazepam），硝西泮（Nitrazepam），奥沙西泮（Ox-azepam）等违禁药物的回收率较好（图2b）。为此，试验选择C18作为QuEChERS前处理方法的净化剂，并与溶剂超声辅助提取法比较。

图2 QuEChERS前处理法提取违禁药物的回收率Fig.2 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment in the different matrix samples

试验选择80%乙腈与50 mmol/L甲酸溶剂超声辅助提取法和C18净化剂QuEChERS前处理方法提取固体药片基质样品中违禁药物的回收率情况，试验结果见图3。除了溶剂提取法萃取哌唑嗪低于80%之外，QuEChERS和溶剂提取方法提取违禁药物回收率均在80%以上，QuEChERS法检测24种违禁药物回收率整体高于溶剂提取法，基于加标回收率判断标准，QuEChERS法与溶剂提取法萃取保健食品中抗炎、镇静安神类违禁药物的回收率满足检测分析标准要求。因此，QuECh-ERS和溶剂提取法两种前处理方法均满足保健食品中抗炎、镇静安神类违禁药物检测要求，试验选择QuEChERS前处理与LC-Q-TOF-MS高分辨质谱法检测保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物。

2.4 方法线性范围、检测限与定量限

LC-Q-TOF-MS高分辨质谱法检测保健食品中24中抗炎、镇静安神类违禁药物，根据目标分析物一级TOF-MS母离子精确质量数、同位素丰度比、二级碎片离子IDA-MS精准质量数及理论质量数与测量质量数误差等信息，定性定量分析24种违禁药物。QuEChERS法与溶剂提取法萃取保健食品中抗炎、镇静安神类违禁药物的回收率满足检测分析标准要求。因此，QuEChERS和溶剂提取法两种前处理方法均满足保健食品中对抗炎、镇静安神类违禁药物的检测要求。以3倍信噪比对应的浓度和10倍信噪比对应的浓度确定24种抗炎、镇静安神类违禁药物的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。目标分析物的线性方程、相关系数、检测限和定量限见表2。24违禁药物线性范围在2个数量级范围之内，相关系数在0.9990以上，检测限在0.3～3 μg/L之间。

图3 QuEChERS与溶剂提取法萃取违禁药物的回收率Fig.3 The recoveries of illicit anti-inflammatory and sedative drugs with the QuEChERS pretreatment and solvent extraction

表2 线性范围、检测限和定量限Table2 Analytical performance data of 24 anti-inflammatory and sedative drugs for linearity of calibration curves，coefficient of determination，LOD and LOQ

2.5 回收率

进一步考察QuEChERS前处理技术与LCQ-TOF-MS高分辨质谱法测定保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物的分析方法可行性与准确性，试验选择某胶囊状保健食品样品，做加标回收率验证试验，在目标物分析线性范围内，选取50 μg/L和150 μg/L两个水平加标浓度，每个浓度平行做3次，平均回收率及相对标准偏差见表3。24种违禁药物50 μg/L加标浓度水平的回收率在82.3%～94.4%之间，RSD为1.5%～8.4%，150 μg/L加标浓度水平的回收率在81.8%～103%，RSD在0.8%～8.7%之间，试验结果显示QuEChERS前处理技术与LC-Q-TOF-MS高分辨质谱法适合保健食品中违禁药物的检测。

表3 加标回收率Table3 The recoveries of 24 anti-inflammatory and sedative drugs

3 结论

建立了同时测定保健食品中24种抗炎、镇静安神类违禁药物的LC-Q-TOF-MS方法，试验优化了QuEChERS与溶剂萃取前处理条件，利用IDA-MS高分辨质谱技术分析目标物，有效避免了样品其它组分的基质干扰，前处理方法简单，检测时间短，可快速检测保健食品中违禁药物成分。