桑树ISSR引物最适退火温度的探究*

刘 玲 唐仕成 柯皓天 吕 银

(1. 四川省丝绸工程技术研究中心， 成都 610031；2. 四川省丝绸科学研究院， 成都 610031)

PCR的退火温度与引物长度、碱基组成和引物浓度有关，ISSR引物的退火温度差异很大是ISSR-PCR反应的突出特点。对于长度低于20bp的引物，Tm值可以按Tm=4(G+C)+2(A+T)计算，ISSR引物一般少于20bp，适用于该公式[1]。但是在实验过程中，往往根据Tm值得不到清晰稳定的扩增条带，因此在正式实验之前，有必要确定每个ISSR引物的最适退火温度。

本试验在已筛选出桑树ISSR-PCR最佳反应体系的基础上，对适合桑树体系的5条ISSR引物的最佳退火温度进行筛选，以优化ISSR标记技术在桑树遗传多样性方面的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料采自四川省丝绸科学研究院桑树种质资源圃。

扩增引物参考加拿大英属哥伦比亚大学UBC公司2006年公布的ISSR引物序列和已有的ISSR分子标记在桑树方面的应用研究结果[2]，从42条引物中筛选出5条引物(表1)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反应所用的Mg2+、dNTPs、rTaq酶、DNA marker和10×Buffer均购自TaKaRa。

1.2 基因组DNA提取及质量检测

基因组DNA提取参照CTAB法，从约0.15g硅胶干燥的嫩桑叶中提取。DNA质量用1%琼脂糖凝胶电泳检测，浓度用微量紫外分光光度计检测确认。

1.3 ISSR-PCR扩增

PCR反应在Thermal Cycler(上海山富科学仪器有限公司)上进行。反应体系(总体积10 μL)：25ng模板1μL、10×Buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5mM Mg2+0.8μL、2.5mM dNTPs 1μL、5U/μL rTaq 0.1μL，加ddH2O 至10μL。

反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s，合适的退火温度退火45s，72℃延伸90s，40个循环，72℃延伸10min，16℃保存。

PCR扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测，电压250V，电流150mA，电泳20～25min，在紫外透射反射仪下观察拍照保存。

1.4 引物退火温度梯度设置

以确定的最佳反应体系为基础，根据引物Tm值设置退火温度梯度范围为Tm±5℃，PCR仪自动生成12个温度。PCR扩增后产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，根据扩增结果确定引物的最适退火温度。每个退火温度扩增设两个重复。

表1 引物信息

Y=(C, T) R=(A, G) V=(A, C, G) H=(A, C, T)

2 结果与分析

2.1 引物退火温度的确定

根据扩增条带是否清晰和检测到的位点数的多少两个方面来确定引物的最佳退火温度。引物ID8扩增效果如图1所示，退火温度为51.1℃时，两个重复的扩增条带一致、清晰、稳定；退火温度低于51.1℃时，杂带增多，且出现两个重复的扩增条带不一致的情况；退火温度高于51.1℃时，扩增条带减少，同样存在两个重复的扩增条带不一致的现象。因此，引物ID8的最佳退火温度应选择51.1℃。本研究中5条引物的最适退火温度见表2。

图1 引物ID8退火温度筛选

引物名称温度梯度/℃Tm值/℃最适退火温度/℃ID541.2,41.5,42.4,43.7,45.2,46.7,48.2,49.7,51.2,53.344.643.7ID846.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.251.1ID1047.7,48.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.252.859.2ID1246.1,47.2,48.5,49.8,51.1,52.4,53.8,54.9,55.750.849.8ID4248.8,50.0,51.4,52.8,54.3,55.7,57.1,58.3,59.2,59.554.358.3

2.2 引物Tm值与最适退火温度扩增效果差异分析

如图2所示，引物ID10的Tm值为52.8℃，在此温度条件下，扩增条带数量少且不清晰，并不是最优结果，而且与试验得到的最佳退火温度59.2℃相差6.4℃，由此可见，引物的Tm值和最佳退火温度之间，不存在明显相关性。

M： Marker

3 讨论

退火温度不同，产生错配的程度不同。较低的退火温度，能提高引物与模板结合的稳定性，但会产生一些非特异扩增。较高的退火温度能保证特异性扩增，但过高的温度会抑制引物与模板的结合。当在几个退火温度下扩增效果差异不大时，应选择较高的温度作为引物的退火温度。本实验过程中，也出现了部分引物(如ID10)，退火温度越高条带越多的情况，这需要重新调整温度梯度范围来寻找最佳退火温度。同时，本研究还发现引物的Tm值与其最适退火温度之间，没有明显相关性。因此在具体研究中，每条引物的最适退火温度需要通过实验获得，而不能仅靠理论推算获得。

目前，在优化ISSR体系的研究中，多采用设置温度梯度确定最佳退火温度。这种方法受到PCR仪自动生成温度的限制，对一些特异性较差的引物效率较低。例如，本实验用到的Thermal Cycler，设置温度梯度时，第1与第2温度点只差0.2℃，第11和第12温度点只差0.3℃，中间第3到第10温度点，每两个温度点之间相差约1.0℃，得到的扩增结果只能代表10个退火温度的情况。

刘丽丽等[3]采用梯度温度PCR和降落PCR相结合，优化东南石栎的ISSR-PCR反应体系，经比较在最适退火温度下，ISSR扩增结果与降落PCR的扩增效果差异不大，由于降落PCR不需要额外进行退火温度的确定，具有明显的便利性，最终采用了降落PCR进行东南石栎的ISSR分析。这种方法给桑树的ISSR分析提供了借鉴。