红茶多酚对H22荷瘤小鼠的免疫调节和抗氧化作用

于 娟 纪海玉 白 云 孙苏军 刘安军

（天津科技大学食品科学与工程学院 天津 300457）

茶是世界上最受大众欢迎的饮品之一，由茶树的芽叶经过萎凋、揉捻、发酵、干燥等典型工艺精制而成[1]。根据制造工艺中发酵程度不同，又可将茶分为绿茶（未发酵）、乌龙茶（半发酵）、普洱茶（后发酵茶）和红茶（全发酵）[2]。红茶中富含多种益于身体健康的抗氧化多酚，如儿茶素、茶黄素和茶红素等[3]，具有多种生物活性。研究发现，红茶多酚不仅在体外表现出较强的清除活性氧自由基的能力[4-5]，还可通过保持抗氧化酶的活性来抑制自由基的生成[6-7]，从而达到抗衰老、减肥的效果。

恶性肿瘤治愈困难，致死率高，是一类危害人类健康的重大疾病[8-9]。化疗是目前针对癌症的主要治疗手段，临床通常采用患者可以耐受的最大药物剂量，然而需延长治疗周期之间的时间间隔，且常会产生具有药物抗性的癌细胞，从而导致病情复发[10-11]。近年来提高机体抗肿瘤免疫能力成为研究热点，通过免疫调节作用清除肿瘤细胞不仅无毒副作用，而且可产生持久的免疫记忆，有效防止肿瘤复发[12]。另外，肿瘤的发生常伴随着自由基对机体的氧化损伤，恶化患者的病情[13]，一些具有抗氧化作用的药物也被用于肿瘤的治疗[14]。

目前对红茶多酚的研究主要集中在其对肥胖、衰老小鼠的抗氧化活性以及体外清除自由基作用上，而对其体内抗肿瘤活性研究较少。本文构建了肿瘤动物模型，研究红茶多酚对荷瘤小鼠的免疫调节和抗氧化作用，为进一步研究其作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、实验动物与试剂

红茶：坦洋工夫红茶，产地福建福安。

实验动物：BALB/c小鼠40只，雌性，体质量19～21 g，北京大学医学部，SCXK（京）2011-0012。

试剂：MTT，美国 Sigma 公司；DMSO，北京索莱宝科技有限公司；FITC-CD3、FITC-CD8、PECD19、PE-CD4单克隆抗体，天津三箭生物有限公司；小鼠IL-2试剂盒、小鼠TNF-α试剂盒、小鼠IFN-γ试剂盒，上海沪峰生化试剂有限公司；SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、MDA试剂盒，南京建成生物工程研究所；其它试剂均为国产分析纯级。

1.2 仪器与设备

Multiskan Ascent全自动酶标仪，美国Bio-Rad公司；FACSCaliber流式细胞仪，美国Becton Dicknson公司；ST16R冷冻离心机，美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 红茶多酚的提取工艺 称取一定量冷冻干燥后的红茶放入烧杯，加入70%乙醇常温浸提1.5 h，抽滤，收集滤液，将残渣以同样的方法再浸提2次，合并滤液，减压浓缩，冷冻干燥后得到红茶多酚粗提物。

采用福林酚法[15]进行测定，以没食子酸作对照，计算得出红茶多酚提取物中多酚含量为23.62%，之后采用大孔树脂进行纯化，其多酚含量可达68.24%。

1.3.2 实验动物分组将40只BALB/c小鼠随机分为4组，分别为空白组[10 mL/（kg·d）生理盐水]、模型组[10 mL/（kg·d）生理盐水]、红茶多酚低剂量组[250 mg/（kg·d）]、红茶多酚高剂量组[500 mg/（kg·d）]，每组10只，灌胃14d后，在除空白组以外的各组小鼠右腋下接种H22肿瘤细胞（2×106细胞/只），然后继续灌胃21 d。

1.3.3 生理指标采集 实验期结束，对小鼠末次灌胃后，断粮12 h，然后断颈处死，解剖取小鼠脾脏、胸腺及肿瘤并称重，计算脾脏指数、胸腺指数及抑瘤率[16-17]。

1.3.4 脾淋巴细胞增殖检测 取各组小鼠脾脏，研磨后用1640培养基调整细胞浓度为2×106细胞/mL，以100 μL/well加入到96孔培养板中，向实验孔分别加入100 μL/well ConA和LPS（终质量浓度为5 μg/mL），对照孔添加相同体积的培养基，置于5%CO2培养箱中，37℃培养44 h[18]，通过MTT法读取570 nm处吸光值检测细胞活性，计算ConA和LPS对脾细胞的刺激指数（SI）得到脾T淋巴细胞（ConA）和B淋巴细胞（LPS）增殖能力。

1.3.5 脾NK细胞活性 用1640培养基将小鼠脾细胞悬液调整成浓度为2×106细胞/mL，将H22细胞浓度调整成1×105细胞/mL。实验孔加效应细胞（脾单个核细胞）和靶细胞（H22细胞）各100 μL/well，效应细胞对照孔加效应细胞和RPMI1640培养基各100 μL/well，靶细胞对照孔加靶细胞和RPMI1640 培养基各 100 μL/well，于 37 ℃，5%CO2培养箱中培养4 h后，通过MTT法测定脾NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[18]。

1.3.6 巨噬细胞吞噬活性检测 将各组小鼠腹腔细胞取出并调整浓度至1×106细胞/mL，以100 μL/well接入96孔板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养4 h后，每孔加入750 μg/mL中性红溶液100 μL，继续培养4 h后，用生理盐水将过量的中性红洗干净，加入100 μL细胞裂解液（乙醇∶乙酸=1∶1，体积比），混匀后 4℃放置过夜，酶标仪在540 nm波长下的读数大小可反映出腹腔巨噬细胞的吞噬能力[18]。

1.3.7 外周血淋巴细胞亚群比例检测 取100 μL各组小鼠外周血并分成2组，均加入2 μL肝素钠溶液（5 mg/mL）抗凝，然后分别加FITC-CD3+抗体和PE-CD19+抗体、PE-CD4+抗体和FITCCD8+抗体各 2 μL，暗处孵育 30 min，除去红细胞和未结合的抗体后重悬于0.5 mL的PBS溶液中，最后通过FCM测定小鼠外周血淋巴细胞亚群水平[18]。

1.3.8 细胞因子检测 各组小鼠血清的IL-2、IFN-γ、TNF-α水平检测均按照试剂盒说明书上的方法进行。

1.3.9 抗氧化能力检测 各组小鼠肝脏组织匀浆的SOD、GSH-Px活力和MDA含量测定均按照试剂盒说明书的方法进行。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 19.0软件进行分析，以平均数±标准偏差（±s）表示，组间均值比较采用单因素方差分析，检验水平为P<0.05时为差异显著，具有统计学意义[19]。

2 结果与分析

2.1 红茶多酚对荷瘤小鼠体质量、脏器指数以及瘤重的影响

各组小鼠适应环境一周后，开始灌胃给药，灌胃14 d后接种H22肿瘤细胞，之后又连续灌胃21 d。由表1可知，灌胃不同剂量的红茶多酚均未影响各组小鼠的体质量，未见明显的消瘦现象及由于药物引起的病变及中毒现象[20]，说明红茶多酚对小鼠无不良影响，而后期由于实体肿瘤的生长导致荷瘤小鼠体质量偏大。

脾脏和胸腺是机体重要的免疫器官，脾脏指数和胸腺指数是反映动物机体免疫功能最基本也是最常规的指标，已被广泛应用于评价机体的整体免疫状态[18，21]。实验期结束后，将荷瘤小鼠断颈处死并解剖，称取各组小鼠的脾脏、胸腺和实体肿瘤，计算得出相应的脾脏指数、胸腺指数和抑瘤率，如表1所示。与空白组相比，模型组小鼠的脾脏明显肿大（P<0.05），胸腺严重萎缩（P<0.05），而灌胃多酚组小鼠的脏器指数较模型组均有明显改善，更接近正常组。结果表明，肿瘤细胞的恶性增殖严重损害了模型组小鼠的免疫系统；而红茶多酚可显著抑制体内肿瘤细胞的增殖，有效地保护了小鼠的脾脏和胸腺，且呈剂量相关性，高剂量组（500 mg/kg）小鼠的抑瘤率可达63.32%。

表1 红茶多酚对荷瘤小鼠免疫器官及肿瘤的作用（±s,n=10）Table1 Effects of black tea polyphenols on tumor-bearing mice（±s，n=10）

表1 红茶多酚对荷瘤小鼠免疫器官及肿瘤的作用（±s,n=10）Table1 Effects of black tea polyphenols on tumor-bearing mice（±s，n=10）

注：*与空白组比较P<0.05；# 与模型组比较P<0.05。

组别 初始体质量/g 最终体质量/g 脾脏指数/mg·g-1 胸腺指数/mg·g-1 瘤重/g 抑瘤率/%空白组19.51±0.27 21.12±0.23 5.116±0.628 1.916±0.066 - -模型组19.52±0.13 21.79±0.22* 9.679±0.922* 1.010±0.282* 2.157±0.217 -低剂量组19.41±0.19 21.49±0.25 7.298±0.402# 1.650±0.048# 1.159±0.217# 46.04高剂量组19.51±0.26 21.37±0.27# 6.269±0.476# 1.886±0.053# 0.791±0.183# 63.32

2.2 红茶多酚对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖活性的影响

结果如表2所示，模型组小鼠的淋巴细胞刺激指数与空白组相比显著降低（P<0.05），而不同剂量的红茶多酚均可显著增强荷瘤小鼠的T细胞（ConA）和B 细胞（LPS）的增殖活性（P<0.05），更接近空白组，并呈现剂量相关性。结果表明，由于体内肿瘤细胞的恶性增殖，导致机体脾脏肿大且细胞活性降低，而红茶多酚能够有效增强荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖活性，从而提高机体的免疫调节能力。

表2 红茶多酚对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（±s,n=10）Table2 Effects of black tea polyphenols on splenocyte proliferation in tumor-bearing mice（±s，n=10）

表2 红茶多酚对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖的影响（±s,n=10）Table2 Effects of black tea polyphenols on splenocyte proliferation in tumor-bearing mice（±s，n=10）

注：*与空白组比较P<0.05；# 与模型组比较P<0.05。

组别 ConA（SI）LPS（SI）空白组1.270±0.002 1.183±0.042模型组0.854±0.028* 0.737±0.02*低剂量组1.098±0.09# 0.939±0.038# 高剂量组1.240±0.04# 1.246±0.016#

2.3 红茶多酚对荷瘤小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响

如图1所示，模型组小鼠的脾NK细胞杀伤能力与空白组小鼠相比显著降低（P<0.05），而与模型组相比，红茶多酚高剂量组可显著提高荷瘤小鼠的脾NK细胞的杀伤能力（P<0.05），而低剂量组虽然也可在一定程度上提高其NK细胞活性，但较模型组无显著差异。结果显示，模型组小鼠由于体内肿瘤细胞的恶性增殖，NK细胞活性受到了抑制，致使其对靶细胞的杀伤百分率较空白组小鼠大幅度降低，而多酚可以增强NK细胞的杀伤活性，抑制体内肿瘤细胞的增殖，提高机体的免疫力。

2.4 红茶多酚对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性的影响

从图2可以看出，模型组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力较空白组显著降低（P<0.05），而红茶多酚可显著增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞对中性红的吞噬能力（P<0.05），且呈剂量相关性。结果表明，红茶多酚能够显著提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的活性，增强机体清除肿瘤细胞的能力，提高机体免疫水平。

图1 红茶多酚对H22荷瘤小鼠脾NK细胞活性的影响（±s,n=10）Fig.1 Effects of black tea polyphenols on the activity of splenic NK cells in H22-bearing mice（±s，n=10）

2.5 红茶多酚对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响

由表3可见，体内H22肿瘤细胞的恶性增殖导致模型组小鼠外周血的淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞的比例比空白组小鼠显著降低（P<0.05），而多酚高剂量组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+T细胞的比例较模型组小鼠均有回升（P<0.05），更接近于空白组小鼠。表明红茶多酚可提高荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞的比例，增强CD4+T细胞的识别能力和CD8+T细胞的杀伤作用，有效抑制体内肿瘤的生长。

图2 红茶多酚对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响（±s,n=10）Fig.2 Effects of black tea polyphenols on phagocytosis of peritoneal macrophage cells in tumor-bearing mice（±s，n=10）

2.6 红茶多酚对荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影响

不同处理对小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影响见表4。模型组小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平显著低于空白组（P<0.05），说明造模成功，而不同剂量的红茶多酚均可提高荷瘤小鼠血清中 IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平（P<0.05）。说明红茶多酚可提高荷瘤小鼠体内相关细胞因子水平，增强机体直接或间接杀伤肿瘤细胞的能力。

表3 红茶多酚对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（±s,n=10）Table3 Effects of black tea polyphenols on lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing mice（±s，n=10）

表3 红茶多酚对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞亚群的影响（±s,n=10）Table3 Effects of black tea polyphenols on lymphocyte subsets in peripheral blood of tumor-bearing mice（±s，n=10）

注：*与空白组比较P<0.05；# 与模型组比较P<0.05。

组别 CD3+ T细胞/% CD19+ B细胞/% CD4+ T细胞/% CD8+ T细胞/%空白组62.79±1.96 26.93±4.33 55.49±8.52 12.82±2.44模型组49.71±1.62* 37.24±5.04* 41.98±3.02* 9.96±1.70*低剂量组51.55±1.65 33.00±3.76 42.575±0.04 11.58±3.84高剂量组58.34±2.49# 30.71±4.70# 46.93±2.00# 14.86±1.88#

表4 红茶多酚对荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影响（±s,n=10）Table4 Effects of black tea polyphenols on the levels of IL-2，IFN-γ and TNF-α in serum of mice（±s，n=10）

表4 红茶多酚对荷瘤小鼠血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α水平的影响（±s,n=10）Table4 Effects of black tea polyphenols on the levels of IL-2，IFN-γ and TNF-α in serum of mice（±s，n=10）

注：*与空白组比较P<0.05；# 与模型组比较P<0.05。

组别 IL-2/pg·mL-1 IFN-γ/pg·mL-1 TNF-α/pg·mL-1 空白组400.72±9.01 148.11±1.29 55.32±0.67模型组341.42±6.05* 127.01±1.94* 33.29±0.58*低剂量组355.68±4.61# 134.98±3.05# 41.55±3.24# 高剂量组381.47±7.59# 144.54±1.11# 50.36±1.83#

2.7 红茶多酚对荷瘤小鼠肝脏SOD、GSH-Px和MDA水平的影响

不同处理对小鼠肝脏组织中SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响见表5。由表5可知，模型组小鼠肝脏组织的SOD、GSH-Px活力显著低于空白组（P<0.05），而MDA含量显著高于空白组（P<0.05），说明造模成功。多酚低剂量组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px活力较模型组显著升高（P<0.05），MDA含量虽略有降低，但较模型组无显著差异；多酚高剂量组小鼠肝脏中SOD、GSH-Px活力较模型组均显著升高（P<0.05），而MDA含量较模型组显著下降（P<0.05）。

表5 红茶多酚对荷瘤小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响（±s,n=10）Table5 Effects of black tea polyphenols on the activities of SOD,GSH-Px and the contents of MDA in liver of mice（±s，n=10）

表5 红茶多酚对荷瘤小鼠肝脏SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影响（±s,n=10）Table5 Effects of black tea polyphenols on the activities of SOD,GSH-Px and the contents of MDA in liver of mice（±s，n=10）

注：*与空白组比较P<0.05；# 与模型组比较P<0.05。

组别 SOD 活力/U·mg-1 GSH-Px活力/U·mg-1 MDA 含量/nmol·mg-1 空白组139.42±1.97 270.81±3.16 8.36±2.71模型组114.86±3.34* 218.65±2.42* 11.11±4.91*低剂量组138.92±9.37# 266.14±9.11# 9.75±3.35高剂量组145.19±6.15# 278.41±8.30# 7.66±2.92#

3 讨论

近年来研究发现，机体发挥抗肿瘤作用是通过非特异性免疫和特异性免疫共同实现的[19]。脾脏和胸腺作为机体重要的免疫器官，在抗肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用，NK细胞可直接杀伤肿瘤细胞，而巨噬细胞则可清除被机体攻击后暴露出抗原的肿瘤细胞。在本实验中，红茶多酚不仅安全无毒，且可有效保护荷瘤小鼠的脾脏和胸腺，高剂量组（500 mg/kg）小鼠抑瘤率可达63.32%，同时显著增强了荷瘤小鼠脾脏T细胞和B细胞的增殖能力（P<0.05）、NK 细胞的杀伤活性（P<0.05）以及巨噬细胞的吞噬能力（P<0.05），从而提高机体整体免疫能力。

在机体抗肿瘤免疫应答过程中，CD4+T细胞不仅参与特异性抗体的生成，同时也在CD8+T细胞攻击肿瘤细胞和形成记忆细胞过程中行使辅助功能，而CD8+T细胞则主要负责攻击肿瘤细胞[22]。IL-2主要参与T细胞的增殖分化和抗体的生成[23]，IFN-γ在机体识别和清除肿瘤细胞过程中发挥重要作用[24]，而TNF-α则是一种能够直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子[25]。本试验中，红茶多酚可显著提高荷瘤小鼠外周血中T细胞的比例（P<0.05），且可显著提高血清中 IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平（P<0.05），从而增强机体抗肿瘤能力，抑制体内肿瘤的生长。

肿瘤细胞可产生大量的自由基，为自身的发展营造高氧化环境[26]。SOD是体内一种能够有效清除超氧阴离子自由基的抗氧化酶，可降低MDA及自由基代谢产物的产生，而GSH-Px是机体内一种可特异性地催化GSH还原过氧化物反应的重要的抗氧化酶，MDA是机体内自由基引发脂质过氧化的一种产物，常被作为评价机体氧化水平的一种指标[27-28]。在本试验中，红茶多酚可显著提高荷瘤小鼠肝脏中SOD、GSH-Px活力（P<0.05），降低MDA含量，呈剂量相关性。表明红茶多酚能够增强机体的抗氧化能力，减少机体自由基含量，有效保护机体重要组织不受损害。

试验结果表明，红茶多酚可有效保护荷瘤小鼠的脾脏和胸腺，并显著增强其脾脏淋巴细胞的增殖能力、NK细胞的杀伤活性和巨噬细胞的吞噬能力，且可提高外周血中T细胞的比例和血清中IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平，增强肝脏组织中的SOD和GSH-Px的活力，降低MDA含量。综上所述，红茶多酚具有良好的抗肿瘤作用，其机制可能与其增强机体的免疫功能和提高机体的抗氧化能力有关，研究结果可为进一步开发和利用红茶提供参考。