桑叶水提物对高脂饮食小鼠脂代谢的调控机制初探

王 玲 邹莉芳 黄先智 丁晓雯*

（1 西南大学食品科学学院 重庆 400716

2 家蚕基因组生物学国家重点实验室 重庆 400716）

高脂膳食通常会导致机体摄入过多的能量，未经消耗的能量将以甘油三酯的形式沉积于脂肪、肝脏、血管等多个组织器官中[1]。不仅造成机体脂肪堆积过度，体重增加，形成肥胖，诱发高脂血症，同时由于过多的脂肪围绕着内脏，使得内脏器官处于亚健康状态，从而引起脂肪肝、心脏病、胰腺炎、中风等病症[2-3]。长期高脂膳食所导致的脂代谢紊乱是引起上述各种疾病的根源，是严重威胁人类健康的一大因素。

在寻求有效改善脂代谢紊乱方法的研究中，开发天然、毒副作用低的保健产品成为一个重要方向，也是当前相关科研领域的一个热点[4]。基于桑叶产量大，资源丰富，且已有前人研究证明其能够预防高脂血症，抑制肥胖[5-7]，本实验室研究人员以桑叶水提物为研究材料，灌胃高脂饮食小鼠，在验证其降脂作用的同时，深入探索其可能的调控途径。关于桑叶水提物在减脂减重方面的效果，前期已做过报道[7]。本文将进一步从桑叶水提物对脂肪合成、分解代谢关键酶活性影响两个方面，探究桑叶水提物在改善脂代谢紊乱时可能的作用机制，同时考察其对实验小鼠在性别和时间上的作用差异。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

300只4周龄昆明种清洁级小鼠，重庆腾鑫比尔实验动物销售有限公司，许可证号：SCXK（渝）2007-006，初始体质量（20±2）g，雌雄各半。

桑叶水提物，杨凌圣桑绿色食品有限公司；DNJ标品（纯度≥98%），北京德威钠生物技术有限公司；甘油三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；脂肪酸合成酶（Fatty acid synthetase，FAS）、激素敏感性脂肪酶（Hormone sensitive lipase，HSL）、脂蛋白脂酶（Lipoprotein lipase，LPL）、肝脂酶（Hepatic lipase，HL）ELISA测定试剂盒，厦门慧嘉生物科技有限公司。

Agilent 1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；F6/10匀浆机，上海弗鲁克流体机械制造有限公司；M680型酶标仪，美国伯乐公司；H2500R-2型冷冻离心机，湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNJ含量测定 用高效液相色谱法[8]测定桑叶水提物中 DNJ含量为（3.43±0.03）mg/mL。

1.2.2 动物饲养 适应性喂养1周后，将300只昆明种小鼠随机分为3个批次，每批次100只，雌雄各半，分别喂养8，12，16周。每批次小鼠设置正常对照组、高脂对照组及桑叶水提物高、中、低剂量组共计5组，每组20只。正常对照组饲喂基础饲料，高脂对照组和各剂量组均饲喂高脂饲料（高脂饲料配方参考文献[7]，由实验室自行配制），同时高、中、低各剂量组还分别按DNJ含量为8.0，4.0，2.0 mg/kg·bw/d灌胃桑叶水提物。每批次小鼠饲养结束后，获取试验材料用于后续分析测定。试验期间小鼠每周称一次体质量，自由摄食、饮水。饲养温度20～24℃，12 h明暗轮换。

1.2.3 试验材料获取 每批次小鼠在进行取材前，禁食不禁水12 h后称重，然后摘眼球取血，所得血液于4℃，4 000 r/min离心15 min，取血清于-80℃保存备用。将取血后的小鼠脱颈处死，解剖，完整摘取肝脏和腹腔脂肪，用预冷生理盐水洗去表面血水，滤纸吸干表面水分后称重，按公式（1～3）计算各基础指标[9]。

称取部分肝组织，按质量比1∶7比例加入PBS 溶液（pH=7.4），制成匀浆液，3 000 r/min 离心15 min，取上清液于-80℃保存备用。

1.2.4 指标测定 用试剂盒测定上述血清中TG、TC、HDL、LDL水平。用ELISA试剂盒测定肝组织中FAS、HSL、LPL、HL活性。均按照试剂盒提供的操作说明测定。

1.3 数据处理

采用SPSS Statistics 19.0软件对试验数据进行显著性分析，P<0.05差别显著。测定结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 桑叶水提物对小鼠体质量的影响

长期高脂饮食会使体质量增长过度，逐渐形成肥胖，严重危害机体健康[2]。抑制体质量增加是缓解高脂膳食伤害机体健康的一项有效措施。桑叶水提物对小鼠体质量的影响见表1。

表1 桑叶水提物对小鼠体质量的影响Table1 Effect of mulberry leaf water extraction on body weight of mice

（续表1）

由表1可知，随着高脂饲料喂养时间延长，小鼠体质量不断增加，造成HFC组体质量增加率远远高于NC组（P＜0.05），可见高脂饮食容易诱导肥胖的发生。HFC组雄鼠体质量增长速度高于雌鼠，且雌鼠在饲喂后期体质量基本不再增加，说明高脂膳食更易导致雄鼠体质量过重；长期饲喂会使雌鼠产生肥胖抵抗，与张婷等[10]研究结果一致。与HFC组相比，饲喂桑叶水提物各剂量组小鼠的体质量增加率均下降，其中HDG组效果最明显（P＜0.05），且当雄、雌鼠分别灌胃 12、8周后，体质量增加率和NC组之间已无显著差异（P＞0.05）。可见灌胃适量桑叶水提物一段时间能够抑制高脂饮食所导致的体质量过度增加，有效控制体质量增长在正常水平，减少肥胖发生。

2.2 桑叶水提物对小鼠腹腔脂肪系数的影响

高脂膳食会造成腹部脂肪蓄积，其占体质量比例的大小能够间接反映高脂膳食所引起的脂代谢紊乱程度[11]。降低腹腔脂肪系数意味着控制脂代谢紊乱，减少肥胖、高脂血症等疾病的发生。桑叶水提物对小鼠腹腔脂肪系数的影响见表2。

表2 桑叶水提物对小鼠腹腔脂肪系数的影响Table2 Effect of mulberry leaf water extraction on abdominal fat factor of mice

由表2可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠的腹腔脂肪系数高于NC组（P＜0.05），且随着饲喂时间延长，腹部脂肪积累越来越多，与NC组相比，HFC组雄、雌鼠腹腔脂肪系数增长率为44.96%，47.41%，55.59%和81.96%，85.06%，87.98%，说明高脂饮食会造成小鼠腹部脂肪过度积累，更易诱发雌鼠发生腹型肥胖[12]。灌胃桑叶水提物有助于降低腹腔脂肪系数，与HFC组相比，各剂量组系数显著降低（P＜0.05），其中HDG组作用效果最好。与NC组比较，HDG组雄鼠灌胃12周时腹腔脂肪系数无显著差异，随后又高于NC组（P＜0.05）；HDG组雌鼠腹腔脂肪系数在整个饲喂阶段显著高于NC组（P＜0.05），未能恢复至正常水平。可见灌胃适量桑叶水提物一定时间可以控制脂代谢紊乱，抑制脂肪蓄积，然而由于高脂膳食更易导致雌鼠脂肪堆积，因此在减少雌鼠腹型肥胖发生率方面，更应该控制饮食结构，避免高脂膳食。

2.3 桑叶水提物对小鼠血脂水平的影响

高脂膳食通常会诱发高脂血症，即血液中TC、TG和LDL-C含量升高，而HDL-C含量降低[13]，不利于机体健康。调控血脂水平，使各类脂蛋白维持在相应水平是保护机体健康的重要措施。

2.3.1 桑叶水提物对小鼠血清中TC含量的影响 血液中TC含量过高会造成血液黏度增加，流通受阻，同时TC堆积还会导致巨噬细胞泡沫化，诱发冠心病和动脉粥样硬化[14-15]。桑叶水提物对小鼠血清中TC含量的影响见表3。

表3 桑叶水提物对小鼠血清中TC含量的影响Table3 Effect of mulberry leaf water extraction on total cholesterol in serum of mice

由表3可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠血清中TC含量显著高于NC组（P＜0.05），且使雄鼠TC浓度上升水平高于雌鼠，喂饲高脂饲料8周、12周和16周时HFC组雄、雌鼠TC浓度分别高于 NC组102.48%，92.42%，88.16%和72.26%，75.53%，66.36%，可见高脂饮食会增加血液中TC水平，且更易诱导雄鼠发生高胆固醇血症，与张婷等[10]研究结果一致。灌胃桑叶水提物可降低TC浓度，与HFC组相比，各剂量组TC水平显著下降（P＜0.05），其中HDG组效果最好；而雄鼠TC含量未能降至正常水平，雌鼠自灌胃8周起已与NC组之间无差异（P＞0.05）。说明桑叶水提物具有良好的降低血液TC水平的作用，减少了胆固醇在血管壁的沉积，抑制动脉粥样硬化的发生。由于高脂饮食使雄鼠TC升得更高，因此桑叶水提物对高脂饮食雄鼠TC的降低作用有限，没能使其恢复至正常水平。

2.3.2 桑叶水提物对小鼠血清中TG含量的影响 血液中TG含量过高同样会使血液黏度增加，导致血液中内含物在血管壁上停留时间过久，形成血栓，诱导动脉粥样硬化的发生[14-15]。桑叶水提物对小鼠血清中TG含量的影响见表4。

由表4可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠血清中TG含量显著高于 NC组（P＜0.05），与NC组相比，喂饲高脂饲料8周、12周和16周的HFC组雄、雌鼠TG浓度上升水平分别为58.85%，62.99%，34.93%和75.89%，75.66%，76.02%。 与HFC组相比，灌胃桑叶水提物使TG含量有所下降，其中 HDG 组效果最好（P＜0.05）；雄、雌鼠分别在灌胃12，8周后，HDG组血清TG水平恢复正常。可见灌胃适量桑叶水提物一段时间可使高脂饮食小鼠血液中TG含量降低至正常水平。

表4 桑叶水提物对小鼠血清中TG含量的影响Table4 Effect of mulberry leaf water extraction on triglyceride in serum of mice

2.3.3 桑叶水提物对小鼠血清中LDL-C含量的影响 LDL-C是血液中TC的主要运输载体，负责将TC转运至全身各处细胞。降低LDL-C水平即意味着降低TC水平[14]。桑叶水提物对小鼠血清中LDL-C含量的影响见表5。

表5 桑叶水提物对小鼠血清中LDL-C含量的影响Table5 Effect of mulberry leaf water extraction on low density lipoprotein cholesterol in serum of mice

由表5可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠血清中LDL-C含量显著高于NC组（P＜0.05），与NC组相比，喂饲高脂饲料8周、12周和16周的HFC组雄、雌鼠LDL-C浓度上升水平分别为68.58%，60.60%，46.71%和33.03%，36.75%，27.09%，可见高脂饮食会增加实验小鼠血液中LDL-C浓度，更易诱导雄鼠LDL-C含量升高。与

HFC组相比，灌胃桑叶水提物可使小鼠血清LDLC 含量降低，HDG 组效果最好（P＜0.05），雄、雌鼠分别灌胃至12，8周后与NC组无显著差异（P＞0.05）。可见灌胃适量桑叶水提物一定时间能够降低高脂膳食小鼠血液中LDL-C含量，使其维持在正常水平。

2.3.4 桑叶水提物对小鼠血清中HDL-C含量的影响 升高HDL-C浓度有助于降低高脂血症发生率[14]。桑叶水提物对小鼠血清中HDL-C含量的影响见表6。

表6 桑叶水提物对小鼠血清中HDL-C含量的影响Table6 Effect of mulberry leaf water extraction on high density lipoprotein cholesterol in serum of mice

由表6可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠血清中HDL-C含量显著低于NC组（P<0.05），且随着饲喂时间延长，HFC组HDL-C含量较NC组的下降率逐渐增大。喂饲高脂饲料8周、12周和16周，雄、雌鼠HDL-C下降率分别为28.12%、33.47%、34.53%和24.47%、31.40%、35.49%，表明长期高脂饮食会持续降低血液中HDL-C浓度，加大患高脂血症几率。与HFC组相比，HDG组雄鼠血清HDL-C水平显著上升（P＜0.05），且与NC组无差异（P＞0.05），而12，16周时较NC组有所下降；各剂量组雌鼠血清HDL-C水平显著上升（P＜0.05），LDG组效果最明显且恢复至正常水平。可见灌胃适量桑叶水提物一定时间可使高脂饮食小鼠血液中HDL-C含量恢复正常水平，然而对于长期进行高脂膳食的雄鼠，桑叶水提物在后期对恢复HDL-C的效果可能会逐渐下降。

2.4 桑叶水提物对小鼠肝脏中脂肪酸合成酶活性的影响

FAS是脂肪酸合成途径中的关键限速酶，在体脂沉积过程中起重要作用[16]。抑制其活性可减少甘油三酯合成，不仅能够降低体脂蓄积，还可抑制脂肪肝发生。桑叶水提物对小鼠肝脏中FAS活性的影响见表7。

由表7可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠肝脏中FAS活性显著高于NC组（P＜0.05），说明高脂饮食会加剧肝脏中脂肪合成，易造成脂肪蓄积。然而随着饲喂时间延长，高脂饮食对FAS活性的影响逐渐降低。喂饲高脂饲料8周、12周和16周，HFC组雄、雌鼠FAS活性较NC组的上升率分别为24.30%，23.98%，19.43%和28.07%，24.23%，10.47%，雌鼠FAS活性在饲喂16周时急剧降低，可能是由于长期高脂膳食引起雌鼠产生肥胖抵抗现象，造成FAS活性下降[17]。灌胃桑叶水提物可降低FAS活性，与HFC组相比，HDG组小鼠肝脏中FAS活性的下降率最高（P＜0.05），且与NC组之间无差异（P＞0.05）。说明灌胃适量桑叶水提物一定时间可有效抑制高脂膳食引起的FAS活性上升，使其维持在正常水平，以减少脂肪酸的过度合成，降低脂肪蓄积，有助于控制脂肪肝的形成。

2.5 桑叶水提物对小鼠肝脏中脂肪分解酶活性的影响

2.5.1 桑叶水提物对小鼠肝脏中LPL活性的影响 LPL可催化水解极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的甘油三酯，释放出游离脂肪酸和单酰甘油以供机体各组织利用[18]。可见使LPL活力增加有利于加速脂肪分解产能，减少脂肪蓄积。桑叶水提物对小鼠肝脏中LPL活性的影响见表8。

表7 桑叶水提物对小鼠肝脏中FAS活性的影响Table7 Effect of mulberry leaf water extraction on fatty acid synthetase in liver of mice

表8 桑叶水提物对小鼠肝脏中LPL活性的影响Table8 Effect of mulberry leaf water extraction on lipoprotein lipase in liver of mice

由表8可知，NC组LPL活性随饲喂时间呈下降趋势，这是由于断奶后小鼠的LPL活性会随小鼠生长而降低[19]。饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠肝脏中LPL活性显著低于NC组（P＜0.05），喂饲8周、12周和16周的HFC组雄、雌鼠LPL活性较NC组下降率分别为7.38%，9.65%，10.19%和27.12%，13.61%，12.75%，可见高脂饮食会抑制LPL活性，不利于肝脏中脂肪分解，且对不同性别小鼠的影响趋势不同。灌胃桑叶水提物可提高LPL活性，与HFC组相比，HDG组雄鼠肝脏中LPL 活性增加率最高（P＜0.05），且当灌胃至 8，12周时，其活性高于NC组（P＜0.05），而持续灌胃至

16周后，与NC组无差异（P＞0.05）；LDG组雌鼠LPL活性增加率最高（P＜0.05），且恢复至NC组水平。可见适量桑叶水提物可恢复高脂饮食小鼠肝脏中LPL活性，促进甘油三酯分解产能，发挥减脂减肥的作用。有研究指出[20]，在高脂血症模型鼠中LPL与HDL-C之间存在相关性，LPL活性上升有助于增加血液中HDL-C含量，抵制动脉粥样硬化的发生。本研究中实验小鼠肝脏中LPL活性上升与前文血液中HDL-C水平增加具有一致性。

2.5.2 桑叶水提物对小鼠肝脏中HSL活性的影响 HSL可水解甘油三酯、胆固醇及其它脂肪，尤其在甘油三酯的降解过程中起着不可或缺的作用。该酶与脂肪甘油三酯酯酶（Adipose triglyceride lipase，ATGL）共同启动甘油三酯的初步分解，可见HSL是脂肪分解过程中的关键酶，增加其活性可降低TG含量[21-22]。桑叶水提物对小鼠肝脏中HSL活性的影响见表9。

表9 桑叶水提物对小鼠肝脏中HSL活性的影响Table9 Effect of mulberry leaf water extraction on hormone sensitive lipase in liver of mice

由表9可知，饲喂高脂饲料使HFC组雄、雌鼠肝脏中HSL活性显著低于NC组（P＜0.05），且随着饲喂时间延长，HFC组较NC组的下降程度逐渐变大，雄、雌鼠HSL活性下降率分别为11.76%，16.18%，21.35%和16.53%，18.89%，21.20%。 而灌胃桑叶水提物有助于增加其活性，与HFC组相比，LDG组雄鼠肝脏HSL活性增加效果最显著（P＜0.05），当灌胃8周时酶活力恢复至NC组水平，灌胃12周时酶活力低于NC组水平，不显著（P＞0.05），持续灌胃16周时酶活力显著低于NC组（P＜0.05），可见给饲喂高脂膳食的雄鼠灌胃适量桑叶水提物一段时间有助于恢复肝中HSL活性，随着长时间高脂膳食对HSL活性抑制程度的增加，桑叶水提物已无法完全弥补该酶活性的损失。雌鼠HDG组LPL活性的增加效果最明显（P＜0.05），且均恢复至正常水平，可见高脂饮食雌鼠对桑叶水提物更敏感，有助于恢复其肝脏中HSL活性，加速脂肪分解。

2.5.3 桑叶水提物对小鼠肝脏中HL活性的影响 HL在脂代谢中的主要作用被认为是促使血液中LDL和乳糜微粒残体进入肝脏，同时加快TC向肝脏的逆运转[23]。可见增加HL活性，有助于降低血液中LDL、TC含量。桑叶水提物对小鼠肝脏中HL活性的影响见表10。

由表10可知，饲喂高脂饲料会使HFC组小鼠肝脏中HL活性显著下降（P＜0.05），喂饲8周、12周和16周的HFC组雄、雌鼠较NC组酶活性下降率分别为18.80%，22.00%，9.15%和15.71%，11.56%，9.64%；与NC组比较，雄鼠饲喂16周时HL活性下降程度不存在显著性（P＞0.05），说明高脂饮食会抑制HL活性，降低脂类分解速度，然而对不同性别小鼠的影响程度不同。

灌胃适量桑叶水提物一定时间有助于恢复小鼠肝脏中HL活性，HDG组的效果最好。与HFC组相比，HDG组雄鼠在灌胃8，12周后，其肝脏中HL活性显著增加（P＜0.05），且恢复至NC组水平。持续灌胃16周，MDG组HL活性反而显著下降（P＜0.05），说明长时间灌胃桑叶水提物或许会抑制高脂饮食雄鼠肝脏中HL活性。与HFC组相比，HDG组雌鼠在灌胃12周后，肝脏HL活性显著上升（P＜0.05），且高于 NC 组水平（P＜0.05），说明给高脂饮食雌鼠灌胃适量桑叶水提物一定时间可有效增加HL活性，加速肝脏中脂肪动员。

表10 桑叶水提物对小鼠肝脏中HL活性的影响Table10 Effect of mulberry leaf water extraction on hepatic lipase in liver of mice

3 讨论

高脂饮食引起的脂代谢异常会造成脂肪沉积，体质量增加过度，形成肥胖。桑叶在抑制脂肪蓄积和肥胖形成方面表现出良好效果，Song等[24]用100 mg/kg·d剂量的桑叶醇提物灌胃高脂饮食小鼠14周，发现与高脂组小鼠相比，实验组小鼠体质量明显降低，同时肾周、附睾脂肪系数均显著下降。结果表明，适量桑叶水提物能够有效降低小鼠体质量的增长和腹腔脂肪系数。

脂代谢异常可直接表现为高血脂症，使血液中TC、TG、LDL含量增加，HDL含量降低，不仅会引起脂质过氧化，产生多种威胁机体健康的物质，还会造成血液黏度增加，血液流通不畅，形成动脉粥样硬化[25-26]。本试验发现灌胃适量桑叶水提物可以使TC、TG、LDL含量显著下降，且HDL含量显著上升，能有效预防高血脂症的发生，这与Sepideh等[27]的研究结果基本一致。他们用桑叶醇提物和桑叶粉末分别灌胃2型糖尿病大鼠，测定大鼠血脂水平，发现TC、TG、LDL含量显著下降，HDL含量显著上升。可见桑叶在抑制高脂血症发生方面具有重要作用。

肝脏作为机体脂代谢的一个重要器官，为脂肪合成及分解代谢提供场所，同时通过分泌各种代谢酶及调控因子来调控脂代谢平衡[28]。FAS是脂肪酸合成过程中的关键限速酶，高脂饮食会诱导FAS基因的高表达[29]，使FAS活性上升，从而过多地合成脂肪酸，造成甘油三酯沉积。试验发现一定剂量桑叶水提物能够抑制高脂饮食小鼠FAS活性，从而减少脂肪酸合成。该结论与chang等[30]发现桑叶多酚可显著降低高脂饮食小鼠肝脏中FAS基因表达的结论一致。

LPL、HSL和HL在脂肪分解代谢方面发挥重要作用，它们具有相似的生理功能，都能够将甘油三酯分解为甘油和游离脂肪酸[18，21-23]。它们的活性增加有助于促进脂肪消耗，加速脂肪动员。本试验发现适量桑叶水提物可使这3种脂肪分解酶的活性上升，说明桑叶水提物能够降脂减肥的一个重要途径是加速脂肪动员，促使其分解成脂肪酸进行氧化产能。

综合上述分析可知，适量桑叶水提物不仅可以抑制脂肪合成，还可增加脂肪分解，从而达到减少脂肪蓄积，抑制体质量过度增加，预防高血脂症的作用。不同性别小鼠对桑叶水提物的敏感度不同，由于雌鼠对桑叶水提物的响应度较高，导致对雌鼠降脂减肥效果更好，而长期灌胃桑叶水提物对雄鼠的效果可能会降低。