缺血性脑卒中患者血清中miR-191、miR-18a的表达与预后关系

张红利，张智芳，白金娟，杜振峰

缺血性脑卒中又名脑梗死，是由脑供血动脉闭塞或狭窄，进而引发脑供血不足，从而造成脑组织坏死的临床常见病症，其致残率及致死率常年居高不下，且预后效果不佳，严重影响患者社会活动及日常生活行为[1]。

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是广泛存在于组织和血液的单链RNA，能够在基因转录过程中发挥调控作用，其在多种疾病中表达失调，可作为多种疾病诊治靶标及预后评估指标[2]。患者发生缺血性脑卒中后，血清中miRNA常呈异常表达[3]。Du等[4]研究发现微小RNA-191(microRNA-191，miR-191)通过靶向VEZF1抑制血管生成，从而促进缺血性脑损伤，miR-191可以作为急性缺血性脑卒中的生物学标志或诊疗靶标。

微小RNA-18a(microRNA-18a，miR-18a)在老年急性心肌梗死患者血清中表达异常，可作为老年急性心肌梗死诊疗及病情评估的临床指标[5]。但miR-191、miR-18a在缺血性脑卒中的研究鲜少，且两者与预后的关系尚未发现有关报道。基于此，本研究初步研究miR-191、miR-18a在缺血性脑卒中患者血清中的表达水平，分析两者对预后的影响，以期为动态监测缺血性脑卒中发病进程，并为临床诊断及预后评估提供参考依据。

1 临床资料与方法

1.1 一般临床资料 选取2016年12月-2019年2月本院诊治的118例缺血性脑卒中患者为脑卒中组，其中男67例，女51例；年龄38～74岁，平均年龄(56.02±9.05)岁。并选取同时间段内招募的健康体检者114例，其中男60例，女54例；年龄37～72岁，平均年龄(55.87±8.94)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有研究对象的吸烟史、高血压史、心脏病史、糖尿病史进行调查，实验室检测低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇水平。

诊断标准：参照《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2014》[6]。纳入标准：(1)所有患者均符合缺血性脑卒中的诊断标准，均经MRI或头部CT证实；(2)所有患者均接受缺血性脑卒中的常规保守治疗；(3)生理病理诊疗资料完全者。预后排除标准：(1)合并血液病、帕金森病、恶性肿瘤者；(2)合并胶原病、自身免疫性疾病者；(3)近期出现急慢性感染、创伤、进行手术治疗者；(4)蛛网膜下腔出血、脑出血者；(5)合并肾衰竭/肾功能不全者；(6)常规保守治疗中死亡者。所有患者或患者家属签署知情同意书，且该研究经本院伦理委员会审核、批准后实施，符合《赫尔辛基宣言》。生活能力评分量表(Modified Rankin Scale，MRS)标准[7]：评分0～6分，0分表现为无症状；1分表现为有症状，可完成日常活动和工作；2分表现为轻度残疾，不需帮助可自我照顾，但不可完成所有以往活动；3分表现为中度残疾，行走无需帮助，但其他日常生活和活动需要一定帮助；4分表现为重度残疾，行走及自身护理均需要帮助；5分表现为严重残疾，大小便失禁，需要护理照顾；6分为死亡。对所有患者治疗结束后3个月时进行门诊随访并进行MRS评分，MRS评分结果范围为0～5分，以MRS评分≤2分为预后良好，≥3分为预后不良。

1.2 主要试剂 TRIzol试剂购买于美国Qiagen公司，miR CURY LNATM Universal cDNA Synthesis Kit、miR CURY LNATM SYBR Green master mix Universal RT均购买于丹麦Exiqon公司；miR-191、miR-18a及U6均由上海生工生物科技有限公司设计并合成。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与处理 所有研究对象于空腹状态下采集8 ml外周静脉血，置于无菌采血管中，静置28 min，4200 r/min离心8 min，轻取上层血清置入EP管中，分成两份，一份置于4 ℃冰箱中保存，一份置于-20 ℃冰箱中冻存，待检。

1.3.2 低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇检测 从4 ℃冰箱中取出保存的血清样本，利用罗氏MODULAR.P800全自动生化分析仪对所有研究对象的血清样本进行低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇水平检测。

1.3.3 实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)法检测血清miR-191、miR-18a水平 从-20 ℃冰箱中取出冻存血清样本，利用TRIzol试剂并按照试剂说明书提取所有血清样本总RNA，利用Amersham Ultrospec2001检测所有样本总RNA纯度、浓度，所有样本总RNA吸光度A260/A280比值均在1.8～2.1范围之内，表明所有样本总RNA纯度较好，样本合格；依据逆转录试剂盒miR CURY LNATM Universal cDNA Synthesis Kit说明书将总RNA反转录成cDNA；按照实时荧光定量PCR试剂盒miR CURY LNATM SYBR Green master mix Universal RT说明书具体操作步骤配制反应体系，并利用MJ Research DNA Engine Option 2 荧光定量PCR仪进行PCR扩增及检测。其中PCR扩增反应条件：预变性96 ℃ 6 min；变性96 ℃ 20 s、退火71.8 ℃ 60 s，35个循环；最终延伸72.0 ℃ 6 min。miR-191、miR-18a均以U6为内参(见表1)。用2-△△CT相对定量法计算血清中miR-191、miR-18a表达水平。

2 结 果

2.1 临床资料比较 与健康组相比，脑卒中组患者在性别、年龄、吸烟史、高血压史、心脏病史、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及总胆固醇等方面差异无统计学意义(P>0.05);在糖尿病史方面具有统计学意义(P<0.05)(见表2)。

2.2 两组血清中miR-191、miR-18a表达水平比较 与健康组相比，脑卒中组患者血清中miR-191表达水平明显升高(P<0.05)，miR-18a表达水平明显降低(P<0.05)(见表3)。

2.3 ROC评价血清中miR-191、miR-18a表达水平对缺血性脑卒中的诊断价值 ROC曲线分析显示，血清中miR-191水平对缺血性脑卒中诊断价值的曲线下面积(area under curve，AUC)为0.878(95%CI:0.833,0.922)，截断值为1.28，其灵敏度、特异度分别为80.5%、83.3%；血清中miR-18a水平对缺血性脑卒中诊断的AUC为0.765(95%CI:0.703,0.826)，截断值为0.86，其灵敏度、特异度分别为71.2%、71.1%；血清中miR-191、miR-18a联合对缺血性脑卒中诊断的AUC为0.907(95%CI0.871,0.944)，其灵敏度、特异度分别为90.7%、75.4%(见图1)。

2.4 两组预后不同缺血性脑卒中患者血清中miR-191、miR-18a水平及MRS评分比较 与预后良好组相比，预后不良组患者血清miR-191表达水平及MRS评分显著升高(P<0.05)，miR-18a表达水平显著降低(P<0.05)(见表4)。

2.5 Logistic回归分析影响缺血性脑卒中预后的因素 以糖尿病史及缺血性脑卒中患者血清中miR-191、miR-18a表达水平和MRS评分为自变量，以缺血性脑卒中预后为因变量，进行Logistic回归分析，结果显示糖尿病史、miR-191、MRS评分是缺血性脑卒中预后的危险因素(P<0.05)，miR-18a是缺血性脑卒中的预后保护因素(P<0.05)(见表5)。

表1 miR-191、miR-18a及内参U6的引物序列

表2 两组临床资料比较(例

与健康组比较*P<0.05

组别例数miR-191miR-18a健康组脑卒中组t值P值114118--1.05±0.311.62±0.39∗12.29701.02±0.280.76±0.21∗8.0190

与健康组比较*P<0.05

表4 两组预后不同缺血性脑卒中患者血清中

与预后良好组比较*P<0.05

表5 影响缺血性脑卒中预后因素的Logistic回归分析

图1 血清中miR-191、miR-18a联合对缺血性脑卒中的ROC诊断价值

3 讨 论

缺血性脑卒中是临床常见的心脑血管疾病，预后差、病死率高是其特点，严重影响患者生存质量，给患者家庭带来极大生活压力[8]。因此，寻找能够早期高效诊断缺血性脑卒中并评估预后指标，对疾病预防控制具有重大临床意义。

miRNA是存在于机体内的非编码单链RNA，在信号转导、组织分化、细胞增殖等生物学过程中发挥重要调节作用。功能性miRNA被认为在缺血期间保护神经和突触的可塑性中起重要作用，在脑损伤[9]、缺血-灌注再损伤[10]、缺血性脑卒中[11]等缺血性疾病或神经系统疾病中表达失调，可作为相应疾病诊断、病情及预后评估指标。Wu等[12]研究发现miR-191可直接作用于胱硫醚-β-合酶，从而促进肾小管上皮细胞凋亡和肾缺血再灌注损伤。miR-191在创伤性脑损伤中表达异常，可作为脑损伤诊断、预后、治疗指标[13]。miR-191a-5p是miR-191其中一员，Zhou等[14]发现脑缺血大鼠经电针治疗后，大鼠原代神经元和皮质中miR-191a-5p表达下调，可增加细胞活力、减少细胞凋亡及梗死体积、改善神经学评分，过表达miR-191a-5p可加剧神经元损伤，并逆转缺血/再灌注损伤后电针治疗的神经保护作用。以上研究表明，miR-191在缺血性或神经系统受损疾病中发挥一定作用。本研究中脑卒中组患者血清中miR-191表达水平明显高于健康组，提示血清中miR-191表达水平可能影响缺血性脑卒中的发病进展。Yang等[15]研究显示三七总皂苷通过上调miR-18a水平，调节血管生成，进而减轻心肌缺血的症状。miR-18a在2型糖尿病患者单个核细胞中表达异常，其可能与2型糖尿病发病相关[16]。此外，罗建华等[5]发现miR-18a老年急性心肌梗死患者血清表达失调，对于诊断、评估老年急性心肌梗死病情具有参考价值。以上研究表明，miR-18a可能对血管异常或其所致的梗死疾病具有一定影响。本研究显示，miR-18a表达水平明显低于健康组，提示miR-18a在缺血性脑卒中发展进程中起到一定作用。

随着头部CT、MRI扫描、多普勒检查技术在医学上的应用，缺血性脑卒中的检出率大幅提高，但检查所需费用高昂，对患者及时治疗有一定影响，因此寻找低价且可早期能够高效诊断、评估病情的临床指标对提高救助患者具有重大意义。血清中miR-191、miR-18a对缺血性脑卒中诊断AUC为0.878、0.765，当血清miR-191相对表达量高于1.28或血清miR-18a相对表达量低于0.86时，缺血性脑卒中患病几率较高，提示miR-191、miR-18a对缺血性脑卒中诊断具有一定诊断效能；血清miR-191、miR-18a联合诊断缺血性脑卒中的AUC为0.907，灵敏度、特异度分别为90.7%、75.4%，提示两者联合可有效提高缺血性脑卒中的诊断效能，有助于更准确的诊断出缺血性脑卒中。

此外MRS评分与缺血性脑卒中预后情况密切相关，故对患者进行MRS评分。本研究显示预后不良组患者血清miR-191表达水平,MRS评分显著高于预后良好组，miR-18a表达水平显著低于预后良好组，提示血清miR-191、miR-18a表达水平及MRS评分对患者预后情况具有较好的临床参考价值。进一步分析发现糖尿病史、miR-191、MRS评分是影响缺血性脑卒中预后的危险因素，miR-18a是影响缺血性脑卒中预后的保护因素，提示血清miR-191、miR-18a表达失调，患有糖尿病史，MRS评分过高均可能使缺血性脑卒中的患病风险增加，及早监控血清miR-191、miR-18a水平，并对治疗后的患者进行MRS评分，有助于诊断并及时控制缺血性脑卒中的发病进展。

综上所述，缺血性脑卒中血清miR-191表达上调，miR-18a表达下调，miR-191、miR-18a均可能参与缺血性脑卒中的发生进展过程，两者联合可有效提高诊断价值，且对预后评估具有一定价值。