miR-134通过介导CCND1表达下调抑制食管癌细胞增殖

李丽娜

(许昌学院医学院,河南 许昌 461000)

食管鳞状细胞癌(ESCC)在我国的发病率逐年升高〔1〕。ESCC患者早期多以胃部烧灼感和吞咽不适等非特异性表征为主，难以获得早期诊治。深入研究ESCC进展机制及诊断标志物对实现食管癌的二级预防具有重要意义。微小RNA(miRNA)是单链的长度较短的RNA，通常其碱基数量在22 bp左右〔2〕。miRNA的异常表达已在ESCC中被证实，其与细胞增殖、侵袭转移〔3〕及血管新生〔4〕有关。miR-134已被查明在多种妇科肿瘤，包括子宫内膜癌〔5〕及乳腺癌〔6〕中的表达水平显著下调。目前，miR-134在ESCC中的含量及生物功能尚不明确。本课题拟研究miR-134在ESCC中的表达水平；利用慢病毒感染特异性上调ESCC细胞中miR-134的表达水平，探究miR-134对ESCC细胞生物学功能的影响。

1 材料和方法

1.1临床标本 选取2015年1月至2018年1月于许昌学院医学院收治并行手术切除的60对ESCC组织及对应癌旁组织(距肿瘤边缘距离>2 cm)标本，男34例，女26例，年龄(56±6)岁。

1.2细胞及实验试剂 ESCC细胞TE-1于许昌学院医学院细胞实验室保存；慢病毒(miR-134及阴性对照)、引物(miR-134及U6)分别由广州复能基因及广州锐博生物科技有限公司提供；DMEM、胎牛血清、Trizol、RT-PCR试剂盒、DyNAmo Flash SYBR Green qPCR试验盒、细胞周期蛋白(CCN)D1抗体(ab134175)、β-actin抗体(ab8226)分别由美国Gibco、美国Invitrogen公司和美国abcam公司提供；噻唑蓝(MTT)药物、膜联蛋白(Annexin)-V/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒由上海生工生物有限公司提供。

1.3qRT-PCR RNA由Trizol试剂按说明书提取。按说明分别组建RT-PCR及real-time PCR体系。RT-PCR条件：反转录，50℃ 30 min；变性，94℃ 2 min；共1循环。Real-time PCR条件：变性，94℃ 15 s；退火，60℃ 30 s；延伸，68℃ 3 min；共40循环；最后延伸，72℃ 10 min。通过2-△△Ct法计算基因相对含量。

1.4慢病毒感染 将TE-1细胞以合适密度接种于6孔板中。过夜培养后洗涤细胞。慢病毒感染分组：miR-134组每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的miR-134慢病毒颗粒及15 μg聚凝胺；miR-NC组每孔包括2 ml含血清DMEM、1 ml的阴性对照慢病毒颗粒及15 μg聚凝胺。转染2 d后，使用特性抗生素溶液筛选稳定转染TE-1细胞。

1.5MTT实验 TE-1细胞分别转染24、48和72 h，按每孔2×104个细胞接种96孔板，每个时间点设置6个平行对照。培养过夜后加入MTT溶液，再次避光培养4 h。吸净上清后每孔用150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液溶解MTT结晶。酶标仪读取490 nm处的OD值。

1.6平板克隆形成试验 在6孔板中均匀接种稳定转染的TE-1细胞，每孔约500个。培养2 w后，多聚甲醛固定细胞、1%结晶紫染色、蒸馏水漂洗、通风橱内风干培养板。计数克隆数量，百分法计算克隆形成率。

1.7流式细胞仪分析 转染72 h后的TE-1细胞用冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，胰酶消化后低速离心获取细胞沉淀，取两份含5×105个细胞的细胞悬液，一份与10 μl PI溶液混合做细胞周期分析；一份与5 μl Annexin V-FITC及10 μl PI混合上机检测细胞凋亡。

1.8Western印迹 细胞总蛋白采用RIPA法提取，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白，70 V湿转120 min转印目标蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭液室温封闭2 h后将目标条带分别置入CCND1和β-actin一抗溶液中在4℃下孵育过夜。1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗在室温中孵育目标条带1 h。电化学发光(ECL)法显影，自动曝光机固定条带影像，计算蛋白相对表达量。

1.9统计学处理 采用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1ESCC组织中miR-134的表达 miR-134在癌旁组织中的表达量(1.377±0.052)显著高于ESCC组织(0.988±0.051；t=5.311，P<0.001)。

2.2miR-134对TE-1细胞增殖及细胞凋亡的影响 miR-134组中miR-134的表达显著高于miR-NC组(14.27±4.03 vs 1.00±0.00；t=8.031，P<0.001)。MTT实验表明，感染72 h后，miR-134组细胞活力与miR-NC组相比显著下降(0.58±0.09 vs 0.71±0.08；t=3.378，P=0.023)。平板克隆形成试验结果表明，与miR-NC组比较，miR-134组显著下调了TE-1细胞的克隆形成能力〔(85.32±10.68)% vs (39.18±13.07)%；t=3.022，P=0.029〕。见图1。

图1 各组平板克隆形成试验(×100)

流式细胞系统检测结果表明，与感染miR-NC组相比，miR-134组细胞凋亡率明显升高〔(12.16±5.23)% vs (37.28±6.14)%;t=4.382，P=0.010〕。见图2。

2.3miR-134对TE-1细胞中CCND1表达的影响 通过生物信息学检索发现CCND1的表达可能受到miR-134的靶向调节。见图3。与miR-NC相比，miR-134组TE-1细胞内CCND1 mRNA(1.00±0.00 vs 0.43±0.15;t=4.031，P=0.011)及蛋白(0.43±0.16 vs 0.12±0.03;t=2.106，P=0.042)水平均显著降低。见图4。这一结果提示CCND1是miR-134的作用靶点之一。

图2 流式细胞仪检测两组细胞凋亡率

图3 miR-134与CCND1 mRNA 3′-UTR结合位点

图4 Western印迹检测两组CCND1蛋白表达

3 讨 论

miR-134位于人类第14号染色体。神经科学研究显示，miR-134对维持生物记忆有重要作用〔7〕，miR-134在神经细胞内表达的维持对减轻癫痫所致神经损伤有重要作用〔8〕。

本研究中通过qRT-PCR检测得知ESCC组织中miR-134的表达水平显著下调，提示miR-134在食管癌中扮演潜在抑癌角色。进一步研究发现，在体外培养环境中，miR-134能够削弱癌细胞活力、增殖能力，并可以促使细胞发生凋亡。有文献报道，miR-134在消化道肿瘤〔9〕转移及肺肿瘤〔10〕耐药中也有调节作用。这些现象充分说明了miR-134的多重抗癌作用，值得深入探究。

miRNA对靶基因具有负向调节作用，其机制是通过与靶基因mRNA的3′端非编码区(3′-UTR)区特异性结合而实现的。通过在线数据检索发现，CCND1 mRNA的3′-UTR存在miR-134的结合位点。进一步实验发现，人为升高miR-134对CCND1的表达具有负向调节效果。CCND1是已知的促食管癌增殖因子〔11，12〕。上述实验证明，miR-134对CCND1的表达调节作用可能是miR-134发挥抗食管癌的机制之一。