金芪汤不同组方对博来霉素致大鼠肺纤维化的治疗作用

郝 梦， 贾春燕， 卢 军， 唐 梅， 赵宇涵， 李风森, 姜 林

(新疆医科大学1第四临床医学院， 2药学院， 乌鲁木齐 830011)

肺纤维化是指正常的肺泡组织被损坏以后进行异常修复，最终导致肺泡组织结构异常，是一种慢性并且不可逆的弥漫性肺间质性疾病[1]。目前大部分肺纤维化病人的病因尚不明确，其病理改变是以肺泡上皮细胞及内皮细胞损伤、成纤维细胞增殖、细胞外基质大量聚集增多以及肺泡间质性炎症为主[2]。近年来肺纤维化的发病率及死亡率逐年上升，目前还没有其他能有效治疗肺纤维化的药物[3]，中西医都在积极探索研究肺纤维化的发病机制以及治疗方法，寻找有效的治疗肺纤维化的药物和防治手段，相比于西医，中医药具有多成分、多靶点、副作用小的特点[4]。中医多将肺纤维化归属于“肺痿”、“肺痹”等病证范畴，认为气虚血淤为其基本病机，故以补气活血、祛痰通络为组方原则组成金芪汤。金芪汤主要由黄芪、金银花、石斛等药材组成，具有益气养阴、祛痰通络、活血化瘀的功效，为新疆维吾尔自治区中医医院呼吸科的临床经验方，在长期临床实践中表明该方具有良好的改善肺纤维化的作用。为进一步优化处方组成，增强疗效，根据中医组方原则和疾病的特点将原处方另拆分为四个不同组方，一并进行实验研究。本实验采用博来霉素(BLM)诱导建立大鼠肺纤维化模型，通过观察肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量变化及肺组织病理学的改变，探讨金芪汤不同组方对肺纤维化大鼠的治疗作用，为金芪汤组方的确定及后续研究提供依据，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器光学显微镜(型号: DM3000B，德国徕卡仪器有限公司)，电子天平(型号：京制00000246号，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，酶标仪(型号：MULTI-SKAN,美国Thermo Scientific公司)，低速离心机(型号：TDZ5WS,长沙湘智离心机仪器有限公司)，高速冷冻离心机(型号：Heraeus Multifuge X1R，赛默飞世尔科技公司)。

1.2 试药与金芪汤组方成分BLM(海正辉瑞制药有限公司，批号17047911)， HYP试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号: 20190521)，马松(Masson)染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：20190128)。金芪汤组方1:黄芪、石斛、三棱、莪术、鹿衔草、木瓜；金芪汤组方2：金银花、石斛、三棱、莪术；金芪汤组方3：黄芪、石斛；金芪汤组方4：黄芪、金银花；金芪汤组方5：金银花。金芪汤汤液生药含量为 1 g /mL，新疆医科大学附属中医医院中药制剂研发实验室制备，药材购自湖北道地药材科技有限公司。

1.3 动物SD大鼠70只，体质量(200±20) g，雌雄各半，购自新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心。在洁净级动物房饲养，大鼠自购入当天开始常规适应性饲养1 w。

1.4 实验方法

1.4.1 肺纤维化大鼠模型的建立 取SD大鼠70只，随机抽取10只为空白组，其余大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g体质量)进行麻醉，将大鼠颈部绒毛剃除，仰卧固定于操作板，操作板下方鼠头一侧垫高30°，无菌条件下，纵向将颈部皮肤剖开，钝性分离，暴露气管，用无菌注射器经气管软骨环间隙斜45°注入BLM (5 mg/kg) 复制肺纤维化实验模型，注入后立即将大鼠立起并旋转，使药物能在肺部均匀分布，缝合，碘液消毒(2～3次/d)，置于洁净级动物房内饲养观察，14 d后给药[5-6]。

1.4.2 实验动物的分组及给药方法 将模型建立成功的60只SD大鼠随机分为模型组(生理盐水6 mL/kg体质量)、金芪汤组方1组(6.21 g/kg体质量)、金芪汤组方2组(6.21 g/kg体质量)、金芪汤组方3组(6.21 g/kg体质量)、金芪汤组方4组(5.5 g/kg体质量)、金芪汤组方5组(2.7 g/kg体质量)，未建立模型的10只SD大鼠为空白组,共7组，每组10只，连续给药28 d。

1.4.3 大鼠一般状态观察 观察实验大鼠的一般状态，包括精神状况、活动情况、呼吸状况、饮食饮水情况、体质量及毛色等。

1.4.4 肺组织HYP含量测定 SD大鼠处死后，生理盐水洗净血液，取肺组织100 mg，采用碱水解法测定HYP含量，实验过程严格按照HYP试剂盒说明书进行。

1.4.5 苏木素-伊红(HE)染色 留取大鼠左肺上叶肺组织，于10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋、切片后，进行HE染色检测。光学显微镜下观察并摄片，比较分析各组大鼠肺组织肺泡炎程度，参照Szapiel的分级标准判定肺泡炎程度。

1.4.6 Masson染色 留取大鼠左肺上叶肺组织，于10%甲醛溶液中固定,常规石蜡包埋、切片后，严格按照Masson染色试剂盒上的步骤进行染色。光学显微镜观察并摄片，比较分析各组大鼠肺组织胶原沉积情况。

2 结果

2.1 大鼠一般状态空白组大鼠精神状态良好，四肢灵活，反应迅速，呼吸顺畅，无咳喘症状，饮食饮水情况正常，体质量增加显著，毛发茂密顺滑有光泽。模型组大鼠精神萎靡，反应迟缓，呼吸短促伴有咳嗽、气喘及嘶鸣声，饮食饮水量较空白组大鼠明显减少，术后1 w内体质量急剧下降，之后体质量增加缓慢。与模型组相比，金芪汤各组的大鼠精神状态较好，活动量较多，呼吸较为平和，饮食饮水量稍多，体质量术后1 w内先急剧下降然后缓慢增加，增加量高于模型组，毛发较为茂密顺滑。实验过程中空白组、模型组、金芪汤组方1组、金芪汤组方2组、金芪汤组方3组、金芪汤组方4组、金芪汤组方5组分别死亡0、3、3、2、2、3、3只。

2.2 各组大鼠肺组织HYP含量变化与空白组比较，模型组大鼠肺组织中HYP含量明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组大鼠相比，金芪汤组方2组、金芪汤组方3组大鼠肺组织中HYP含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，金芪汤组方1组、金芪汤组方4组、金芪汤组方5组大鼠肺组织中HYP含量降低，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组大鼠肺组织HYP含量比较

注：与空白组比较，#P<0.05， 与模型组比较，*P<0.05。

2.3 HE染色结果空白组大鼠肺泡结构基本完整，无明显炎症及纤维化特征，肺泡间隔未见增厚。模型组大鼠肺泡结构紊乱，肺泡腔广泛的缩小或消失，肺泡壁显著增厚增宽，以大量胶原纤维增生、纤维组织为主，并存在大量炎性细胞浸润。金芪汤各组大鼠肺组织分别与模型组比较，上述病理改变均有不同程度减轻，其中金芪汤组方2组与金芪汤组方3组改善较为明显，差异有统计学意义(P<0.05)，金芪汤组方1组、金芪汤组方4组、金芪汤组方5组，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图1。

表2 各组大鼠肺泡炎病理学积分情况

注：与空白组比较，#P<0.05， 与模型组比较，*P<0.05。

2.4 Masson染色结果空白组大鼠肺泡结构完整清晰，间隔未见增厚，有少量蓝色的胶原纤维分布。与空白组相比，模型组肺泡间隔宽厚，可见大量蓝色的胶原纤维沉积，颜色较深，弥漫性纤维组织形成；与模型组比较，各给药组肺泡间隔较窄，蓝色的胶原纤维沉积量减少，纤维化程度较轻。其中金芪汤组方2组与金芪汤组方3组改善较为明显，见图2。

a：空白组

b：模型组

c：金芪汤组方1组

d：金芪汤组方2组

e：金芪汤组方3组

f：金芪汤组方4组

g：金芪汤组方5组

图1 各组大鼠肺组织HE染色比较(×200)

a：空白组

b：模型组

c：金芪汤组方1组

d：金芪汤组方2组

e：金芪汤组方3组

f：金芪汤组方4组

g：金芪汤组方5组

图2 各组大鼠肺组织Masson染色比较(×200)

3 讨论

肺纤维化预后不良，致死率高，西药治疗的副作用较为严重，所以开发中医药治疗肺纤维化具有积极意义[7]。肺纤维化以肺泡间质性炎症、成纤维细胞大量增生、细胞外基质聚集增多为主要病理改变。其临床症状以逐渐加重的咳嗽、喘息、气急为主[8]。肺纤维化动物模型被广泛用于肺纤维化发病机制及相关药物的研究。BLM性质比较稳定，能被组织细胞所吸收，对肺脏的毒副作用明显，是用于建立肺纤维化模型的常用诱导剂，其病理组织学改变与人类肺纤维化最为相似[9-12]。大鼠造模后肺部前期以炎症为主，后期以纤维化为主。本实验采用气管内注入BLM的方法制备大鼠肺纤维化模型，造模14 d后，随机抽取2只大鼠进行病理学检查，发现模型制备成功，开始给药，以此来评价金芪汤各组药物改善纤维化的作用。

金芪汤各组方能够较好地改善BLM所致肺纤维化大鼠的精神状态、灵敏度、呼吸状况、饮食饮水情况、体质量以及毛色等一般情况。 HYP在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中几乎没有[13]，可间接反映胶原含量和器官纤维化的程度[14]。本研究发现，与空白组相比，模型组的HYP含量明显增加，表明采用BLM气管内注入方法成功制备了大鼠肺纤维化模型。与模型组相比，金芪汤组方2组、金芪汤组方3组大鼠肺组织中HYP含量明显降低，表明金芪汤组方2组、金芪汤组方3组能显著降低肺组织内胶原纤维含量，减轻肺纤维化程度。病理形态学观察是研究肺纤维化病理发展过程最直观显著的指标，本研究采用HE 染色和Masson染色观察各组大鼠肺组织病理学变化，发现与空白组相比，模型组大鼠肺组织呈现明显的肺纤维化病理改变，与模型组相比，金芪汤组方2组、金芪汤组方3组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度明显减轻。

综上所述，金芪汤不同组方均能不同程度改善BLM致大鼠的肺纤维化程度。其中金芪汤组方2组、金芪汤组方3组能显著降低BLM致肺纤维化大鼠肺组织HYP含量，减轻其肺泡炎及肺纤维化程度。临床上肺纤维化的治疗还没有理想的药物，本研究提示金芪汤组方2、组方3能显著改善博来霉素诱导的肺纤维程度，有望成为治疗肺纤维化的候选药物，但其作用机制有待研究。同时本研究也为金芪汤组方的确定及后续研究提供了依据。