糖耐量正常人粪样微生物移植对胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢的影响

田滋润， 王 烨， 韩 雪， 高 丽， 谷娇娇， 王晓晓， 李琳琳

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

近年来，随着与2型糖尿病相关研究的深入，人们发现2型糖尿病的发生除了受遗传因素和多种环境因素共同诱导外，肠道菌群在2型糖尿病的发生中也起着重要作用。目前，大量研究表明，肠道菌群结构的改变是引起肥胖和胰岛素抵抗等代谢性疾病的主要原因之一[1-3]。随着肠道微生物学研究的深入，粪样微生物移植技术应运而生。粪菌移植[4]是指通过将健康供体的肠道微生物移植到患病受体肠道内，重建患病受体肠道微生态系统，从而达到实现治疗疾病目的的一种技术手段。本课题组前期研究结果表明，糖耐量正常人粪样共生菌液，对高脂饲养诱导的C57BL/6J胰岛素抵抗小鼠具有防治作用。本研究在其基础之上，通过制备糖耐量正常人粪样共生菌液、菌悬液和无菌滤液，探究糖耐量正常人粪样微生物移植在改善小鼠胰岛素抵抗过程中，观察肠道微生物、肠道微生物的代谢产物的作用，或两者共同的作用。为粪菌移植在治疗2型糖尿病的发病机制研究方面提供更坚实的基础依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物C57BL/6J小鼠，雄性，鼠龄6～8周龄，体质量18～22 g，125只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2016-0006，实验动物质量合格证:11400700307064。

1.2 仪器与试剂全自动酶标仪(Multikan GO, Thermo)，离心机(MULTIFUEGX-3R,Thermo Fisher)，高压蒸汽灭菌器(SANYO公司，型号：MLS-3750)，电子分析天平(赛多利斯天平有限公司)，胆固醇及甘油三酯测定试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司，批号20180212)，血清胰岛素ELISA试剂盒(英诺诊断有限公司)，96孔板(Labserv.Cat.No.310109008)，无水葡萄糖(天津盛奥化学，批号20170825)。

1.3 供体的选择和供体粪样的收集处理

1.3.1 样本收集的伦理审核 供体粪便样本的收集和动物实验研究均通过了新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准(20130216-141)。

1.3.2 供体纳入排除标准

1.3.2.1 供体的纳入标准 选取年龄18～40周岁，在其生活地区稳定居住期超过10年的男性或女性，且具有长期健康的生活方式和良好的饮食习惯及规律的排便习惯。供体空腹血糖(FBG)≤5.6 mmol/L(101 mg/dL)，随机血糖(GLU)≤11.1 mmol/L(200 mg/dL)或经口服葡萄糖耐量实验(OGTT)后2 h FBG≤7.8 mmol/L(140 mg/dL)[5]。

1.3.2.2 供体的排除标准 (1)孕妇、哺乳期妇女；(2)有精神病史，滥用药物人群；(3)有手术及其他应急情况人群；(4)近期服用抗菌素，甾体类药物或微生态制剂人群；(5)有明显肝肾功能损害，慢性肠胃功能紊乱，有腹泻、胆道感染病史和肠炎等胃肠道疾病，血液系统或其他内分泌系统疾病人群；(6)需要胰岛素治疗或有酮酸中毒病史人群；(7)排除1型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠糖尿病人群。

1.3.3 供体粪样的收集 将收样用无菌容器、肛拭子称重后在高压灭菌锅121℃灭菌30 min，灭菌完成后，将无菌容器、肛拭子、冰袋、手套、放入泡沫盒中交与筛选合格的供体，并嘱咐取样事宜：早晨，使用肛拭子铲取大便中末段，将新鲜粪便样品收集到无菌容器中并密封容器，立即拿回实验室，称重记录后，将样品迅速转入无菌生物安全柜[6-7]。

1.3.4 供体粪样的处理

1.3.4.1 供体粪样共生菌液的制备 参考粪菌移植Amsterdam规范和相关粪菌移植文献[8-11]。称取转入无菌生物安全柜的样品100 g，置于搅拌器中，加入500 mL无菌生理盐水，并搅拌均匀，使其浆体首先通过不锈钢滤网并过滤以除去大颗粒物质，然后逐级透过不锈钢滤网(2.0、1.0、0.5、0.25 mm孔径)以除去粪液中未消化的食物和小微粒状物质，即得到粪样共生菌液，用含20%无菌医用甘油的生理盐水将此溶液等比例稀释，分装至5 mL冻存管，封口膜封口，迅速转移至-80℃低温冰箱保存。

1.3.4.2 供体粪样菌悬液的制备 将“1.3.3.1”步骤中得到的粪样共生菌液分配到多个50 mL无菌离心管中，并以12 000 r/min离心10 min，离心后，将离心管下层的沉淀富集，将沉淀重悬浮于等体积0.9%氯化钠溶液中，即得到粪样菌悬液，用含20%无菌医用甘油的生理盐水将此溶液等比例稀释，分装至5 mL冻存管，封口膜封口，迅速转移至-80℃低温冰箱保存。

1.3.4.3 供体粪样无菌滤液的制备 将“1.3.3.2”步骤中各离心管上层粪样液体，转移到无菌烧杯中，并通过抽滤装置，(抽滤装置中的一次性纤维素纸孔径0.22 μm )抽滤2次，即得到粪样无菌滤液，分装至5 mL冻存管，封口膜封口，迅速转移至-80℃低温冰箱保存。

1.4 实验方法

1.4.1 小鼠胰岛素抵抗模型的建立 取6～8周龄18～22 g雄性C57BL/6J小鼠 125只，单笼单只饲养，环境为12 h/12 h光照和黑暗交替，正常饮食饮水，饲料为SPF级，适应性喂养1周后，随机选择10只继续普通饲料饲养，为空白对照组(NCD)，余下115只进行高脂饲料饲养，即为高脂组。在高脂组饲养至8周末时，分别检测每只小鼠的GLU, FBG, 总胆固醇(TC)和 甘油三酯(TG)水平，并对每组小鼠进行OGTT和胰岛素耐量实验(Insulin tolerance test , ITT)，收集每只小鼠的粪便样本。

1.4.2 实验动物的选取和分组 根据高脂组小鼠8周末ITT实验数据，选出40 min血糖下降百数小于40%的小鼠，综合其空腹血糖水平、随机血糖水平、空腹血浆总胆固醇水平、空腹血浆甘油三酯水平、体质量指标，筛选出胰岛素抵抗小鼠随机分为选出52只胰岛素抵抗小鼠，进行后续的治疗实验。将造模成功的小鼠随机分为：高脂饮食组(High fat diet , HFD) 13只，高脂+供体粪样共生菌液组(High fat diet+Donor fecal symbiotic bacteria liquid , HFD+DFSBL) 13只，高脂+供体粪样菌悬液组(High fat diet+Donor fecal bacteria suspension , HFD+DFBS)13只 ，高脂+供体粪样无菌滤液组(High fat diet+Donor fecal sterile filtrate, HFD+DFSF) 13只。

1.4.3 实验动物检测指标 每组小鼠干预后，每周称取体质量，在粪菌干预8周末分别检测小鼠的随机血糖、空腹血糖、血浆总胆固醇和血浆甘油三酯水平，并进行口服葡萄糖耐量实验。

2 结果

2.1 供体粪样微生物移植对小鼠体质量的影响实验结果表明，与NCD组小鼠体质量相比，HFD组小鼠体质量在实验的0到8周，均有显著增加，差异有统计学意义(P<0.001)。与HFD组相比，HFD+DFBS组小鼠体质量在实验的4到8周开始得到控制，但差异无统计学意义。其他干预组小鼠体质量与HFD组相比，差异均无统计学意义。具体结果见表1。

表1 粪样微生物移植对小鼠体质量的影响

注: 与NCD组比较,***P<0.001。

2.2 供体粪样微生物移植对小鼠血糖水平的影响

2.2.1 供体粪样微生物移植对小鼠FBG的影响 第8周实验结果显示，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠FBG有显著增加，差异有统计学意义(P<0.001)。与HFD组相比，HFD+DFSBL组和HFD+DFBS组小鼠FBG水平下降，但差异无统计学意义。具体结果如图1(A)所示。

2.2.2 供体粪样微生物移植对小鼠GLU的影响 第8周实验结果表明，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠GLU均有显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。与HFD组相比，HFD+DFSBL组、HFD+DFBS组和HFD+DFSF组小鼠GLU在实验8周上升趋势得到控制，但差异无统计学意义。具体结果如图1(B)所示。

2.2.3 供体粪样微生物移植对小鼠OGTT的影响 第8周实验结果显示，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠OGTT曲线下面积，有较明显的升高，差异有统计学意义(P<0.001)。与HFD组相比，HFD+DFSBL组和HFD+DFBS组小鼠OGTT曲线下面积较明显得到控制，差异有统计学意义(P<0.001～0.01)。HFD+DFSF组小鼠OGTT曲线下面积无统计学差异，具体结果见图1(C)所示。

注: 与NCD组比较， ***P<0.001， **P<0.01；与HFD组比较， ###P<0.001, ##P<0.01。

2.3 供体粪样微生物移植对小鼠血脂水平的影响

2.3.1 供体粪样微生物移植对小鼠TC的影响 第8周实验结果表明，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠TC含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.001)。与HFD组相比，HFD+DFSBL组小鼠TC含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；HFD+DFBS组和HFD+DFSF组TC含量上升趋势得到控制，但差异无统计学意义。具体结果如图2(A)所示。

2.3.2 供体粪样微生物移植对小鼠TG的影响 第8周实验结果显示，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠TG含量有较明显的升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与HFD组相比，HFD+DFSBL组TG含量上升趋势得到控制，但差异无统计学意义；HFD+DFBS组和HFD+DFSF组无明显变化。具体结果见图2(B)所示。

注: 与NCD组比较， ***P<0.001， *P<0.05； 与HFD组比较， #P<0.05。

3 讨论

本实验在课题组前期研究的基础上，主要是通过建立动物胰岛素抵抗模型，分别给予胰岛素抵抗小鼠不同的粪样处理液体，旨在观察不同的粪样移植物对胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢基础指标的影响，是菌群在改善胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢指标时起作用，还是菌的代谢产物在起作用，还是菌群+代谢产物的作用大于两者单独使用。实验结果表明：与高脂造模组小鼠相比，给予糖耐量正常人粪样共生菌液和粪样菌悬液的胰岛素抵抗小鼠，它们的随机血糖水平、血浆总胆固醇水平、甘油三酯水平和口服葡萄糖耐量实验曲线下面积呈下降趋势，糖耐量正常人粪样中确实存在改善胰岛素抵抗小鼠糖脂代谢指标的靶标菌或菌群，且靶标菌或菌群的作用可能优于其代谢产物的作用。对于是粪样中哪种菌或菌群在起主要作用，这种菌或菌群又是通过哪种方式来影响胰岛素抵抗相关表型指标的变化，需要本课题进一步的深入研究。