不同土地利用方式下酚酸物质与土壤微生物群落的关系

及 利, 杨雨春, 王 君, 杨立学

1 森林生态系统可持续经营教育部重点实验室，东北林业大学林学院，哈尔滨 150040 2 吉林省林业科学研究院, 长春 130033

土地利用是人类干预土壤质量最重要、最直接的活动,它长期持续地改变着土壤结构、养分以及土壤生物的代谢活动,进而使土壤供应植物的营养水平发生变化[1]。土地利用的变化对陆地生态系统的生物地球化学循环进程有重要的影响[2- 4],土地利用方式的改变影响着土壤养分的循环与供应,直接造成土壤质地和地下微生物群落结构的变化,调整着陆地生态系统的结构与功能[5- 7]。

土壤微生物对土地利用的变化十分敏感,Potthast等[8]通过对厄瓜多尔南部地区森林、放牧草原和撂荒地的比较分析发现,森林和撂荒地的微生物活性较低,草原的微生物量碳含量为3445 mg/kg,是森林和撂荒地的3倍以上。Tischer等[9]认为土地利用方式和土层深度对微生物生态化学计量有显著的影响,相比与微生物碳∶氮(C∶N),随着土层深度增加,微生物氮∶磷(N∶P)和碳∶磷(C∶P)有显著升高的趋势。Song等[10]发现与原始森林相比,次生林和人工林的真菌、细菌和总微生物量有显著降低的趋势,植被群落和土壤制度的差异导致了微生物群落的变化。土壤干扰对微生物群落结构有重要的影响,未割草的休耕地下的微生物PLFA浓度高于割草处理和撂荒地的,与施肥相比,土地利用方式对微生物生物量和群落结构有更显著的影响,休耕地下的革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌(G+/G-)和真菌/细菌(F∶B)显著高于4种施肥处理[11]。

通过地上植被的皆伐和火烧等措施,在土地利用方式的转变或森林植被类型的转换过程中伴随着土壤养分的遗留作用,该作用也影响着地下微生物的变化,与植被和土壤质量相比,土地利用历史对微生物有着更加显著的影响[12- 14]。在一定程度上,养分遗留造成的变化与植物合成存留在土壤中的次生代谢产物对微生物的影响有关。酚酸物质不仅对植物生长有促进或抑制作用,而且对微生物的分布区系也有显著影响[15- 19]。Qu和Wang[20]通过向大豆土壤施加2, 4-二叔丁基苯酚和香草酸,发现酚酸处理后对真菌有显著影响而对细菌则只有轻微的变化。Stringlis等[21]发现具有抗菌活性的根系分泌物香豆素调控微生物群落的变化,抑制病原体尖孢镰刀菌及黄萎病菌的生长。Zhou等[22]认为p-香豆素能分别降低和增高细菌和真菌群落的多样性,能够抑制有利于植物生长的微生物的生长,如Lysobacter,Haliangium和Gymnoascusspp.。然而,大多数研究在酚酸与微生物群落之间的关系方面只关注于室内试验添加外源酚酸的研究,而野外自然条件下酚酸与微生物群落的关系却鲜见报道。及利等[23]发现采煤沉陷区不同树种恢复造林过程中,阿魏酸、松香酸和β-谷甾醇对微生物量有明显的促进作用,与真菌和真菌/细菌(F∶B)存在显著正相关关系。

众多学者研究了不同土地利用方式条件下微生物群落结构与土壤酶、土壤养分生态化学计量、pH的关系[24- 27],而由于根系分泌、凋落物分解和地上淋溶等作用产生的土壤酚类物质与微生物群落结构的关系还鲜见报道。凋落物和根系分泌物对微生物提供碳源,细菌和真菌将其分解,间接地改变了土壤pH和养分比例,尤其是C∶N。因此,地假设不同土地利用方式中的土壤酚类物质与土壤微生物的相关程度密切。本研究旨在探究四种不同土地利用方式下不同形态的土壤酚类物质和9种具体的酚酸物质与土壤微生物之间的关系,为酚类物质在土壤中的作用以及对微生物的影响提供依据,以期为更好地理解土地利用方式变化对微生物群落影响的作用机制提供一定的理论基础。

1 研究地区与研究方法

1.1 研究区概况

研究地点位于龙江森林工业集团总公司山河屯林业局奋斗林场(127°22′—127°24′E,46°21′′—46°37′N)。该地区地处中温带大陆性季风气候区,冬季干燥寒冷,夏季温润炎热,年平均气温在2.7—3.0℃之间,极端最低气温-42℃,极端最高气温36℃,平均年降水量达600—800 mm,无霜期110—128 d,土壤类型为Hap-Boric Luvisol[28]。

1.2 试验设计及取样方法

2014年7月中下旬,在奋斗林场试验地选择立地条件一致的次生林(SF)、20年生落叶松纯林(LP)、农田地(FL)、撂荒地(AL),每个土地利用方式内分别设置3个20 m ×30m的样方,各样方自距离不超过1000 m(表1)。样方四角用木桩做好标记,便于取样。次生林的主要乔木树种有蒙古栎(Quercusmongolica)、水曲柳(Fraxinusmandschurica)、落叶松(Larixgmelinii)、红松(Pinuskoraiensis)、春榆(Ulmusdavidianavar.japonica)等,主要灌木为暴马丁香(Syringareticulatavar.amurensis)、山荆子(Malusbaccata)、茶条槭(Acerginnala)、色木槭(Acermono)、稠李(Padusracemosa)等,主要草本为东北茶藨子(Ribesmandshuricum)、水金凤(Impatiensnoli-tangere)、木贼(Equisetumhyemale)、蚊子草(Filipendulapalmata)等;落叶松人工林林分密度为1300 株/hm2,主要草本为鸡树条荚蒾(Viburnum sargenti Koehne)、水金凤(Impatiensnoli-tangere)、木贼(Equisetumhyemale)、悬钩子(Rosarubus)等。农田地主要种植玉米,耕作超过10年以上。撂荒地撂荒超过5年以上,无乔木和灌木生长,主要草本为水金凤(Impatiensnoli-tangere)、木贼(Equisetumhyemale)悬钩子(Rosarubus)等。4种土地利用方式的坡度均在5—10°之间。

2014年8月初,在每个样方内随机选取5个样点,用土钻取0—5 cm、5—10 cm和10—20 cm层的土样(土钻口径×深度为10×20 cm),装于自封袋中放入便携式冰箱中低温保存运回(FD- 1A- 50 Boyikang Experiment Instruments Co., Beijing)。将取得的部分土样过2 mm筛(10目)后冻干,之后置于-80 ℃冰箱保存,用于测定磷脂脂肪酸种类和含量;将部分土样风干,用于酚类物质以及酚酸物质含量的测定。

1.3 酚类物质的测定

土壤总酚、复合态酚和水溶性酚含量的测定参照叶发茂[29]的方法使用福林酚法测定。

表1 4种不同土地利用方式的主要特征(0—20 cm层)

不同字母代表差异显著(P<0.05)

1.4 9种酚酸物质含量的测定

样品的测定采用高效液相色谱法(HPLC),高效液相色谱仪为Agilent 1200,色谱柱为Zorbax SB-C18反相柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),土壤中不同物质的HPLC检测条件和检测方法不尽相同,根据相关文献的记载和实践验证[23],综合得出改进后的方法分别测定阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸、间苯三酚等9种酚酸物质(表2)。

1.5 磷脂脂肪酸(PLFA)的测定

土壤微生物群落采取磷脂脂肪酸(PLFA)方法进行测定。磷脂脂肪酸的提取方法主要参照Frostegard的方法[30]。测试仪器为气象色谱质谱联用仪(GC-MS, Varian 450-GC and Varian 240-MS),GC条件：石英毛细管柱DB- 5(30 m×0.25 mm,膜厚0.25 μm),柱温60℃。每种处理称取1 g土样,样品提取所用溶剂均为分析纯,十九酸甲酯标准品购于美国AccuStandard有限公司,所有玻璃器皿使用前用正己烷润洗。

通过将标准物质十九酸甲酯的相对保留时间及质谱图与数据库中进行对比,来确定PLFAs的含量。PLFAs的定量由内标法确定。脂肪酸12:0、14:0、15:0、16:0、17:0、18:0、20:0、i15:0、a15:0、i17:0、10Me18:0、16:1ω7、16:1ω9c、18:1ω9、cy17:0、cy19:0代表细菌[31,32],18:lω9c,18:1ω9代表真菌[33,34]。

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS19.0软件处理数据。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验不同处理之间的差异(LSD,α=0.05)。线性方程拟合采用逐步回归法;相关分析采用Pearson法(双侧检验)。应用Canoco for Windows 4.5软件对酚酸物质与土壤微生物间的关系进行冗余分析(Redundancy analysis,RDA),用R语言vegan包分析酚酸物质对微生物群落的贡献。在SigmaPlot 12.0软件中作图。所有数据为平均值±标准误。

表2 9种酚酸物质的HPLC测定条件

X: 酚酸物质的浓度 Concentration of phenolic acids;Y: 峰面积 Peak area

2 结果与分析

2.1 不同土地利用方式下土壤酚类物质和酚酸物质的变化特征

不同土地利用方式之间的土壤总酚和水溶性酚含量存在显著差异(图1,P<0.05)。落叶松人工林土壤各土层的总酚含量最高(P<0.05),0—5 cm层中,分别比次生林、农田地和撂荒地高44.88%、63.62%、112.01%。在0—5 cm和5—10 cm层中,落叶松人工林土壤水溶性酚含量显著高于其余三种土地利用方式(P<0.05),而在10—20 cm层中,则是次生林最高(P<0.05)。总体上,随着土层深度的加深,四种土地利用方式下土壤总酚和复合态酚含量呈逐渐降低的趋势。

图1 不同土地利用方式下土壤总酚、复合态酚和水溶性酚含量的垂直分布 Fig.1 The vertical distribution of soil total phenol, complex phenol and water-soluble phenol content under different land uses不同字母代表差异显著(P<0.05);SF、LP、FL和AL分别代表次生林、落叶松人工林、农田地和撂荒地

4种土地利用方式下,9种酚酸物质含量差异显著(P<0.05,表3)。总体上,间苯三酚、莽草酸、肉桂酸和β-谷甾醇在各种土地利用方式中的含量较高。在0—5 cm层中,β-谷甾醇在次生林中的含量最高且显著高于其他三种土地利用方式,香豆素和肉桂酸在农田地中的含量最高且显著高于撂荒地,松香酸在撂荒地中的含量最高,撂荒地中松香酸的含量显著高于其他土地利用方式。

总体上,随着土层深度的加深,阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸、香豆素、β-谷甾醇和莽草酸的含量呈逐渐减小的趋势,而肉桂酸在不同土层深度之间则变化不明显,齐墩果酸含量表现为先降低后升高的趋势;随着土层的加深,松香酸含量在次生林中表现为先升高后降低,在落叶松和农田地中的表现为先降低后升高,在撂荒地表现为持续降低的趋势;间苯三酚的含量在天然林表现为逐渐降低的趋势,在落叶松和农田地表现为先降低后升高,在撂荒地则表现为先升高后降低的趋势(表3)。

2.2 不同土地利用方式下土壤微生物群落的变化

土地利用方式对土壤微生物群落存在显著影响(图2,P<0.05)。在0—5 cm层,落叶松人工林的总PLFA、细菌和真菌含量分别为105.80、91.02和9.43 nmol/g,显著高于农田地和撂荒地(P<0.05),而F∶B则是次生林最大,显著高于其余三种土地利用方式(P<0.05)。在5—10 cm层中,次生林的土壤总PLFA和细菌群落显著高于落叶松人工林,分别高135.23%和131.59%(P<0.05)。总体上,随着土层深度的加深,次生林和落叶松人工林的真菌和F∶B呈逐渐降低的趋势。

2.3 土壤酚类物质与土壤微生物群落的相关性

土壤总酚和水溶性酚与土壤微生物群落存在显著的相关关系(P<0.05,图3)。在0—5 cm层中,土壤总酚与总PLFA和细菌含量极显著正相关(P<0.01),与真菌含量显著正相关(P<0.05),而在0—5 cm层土壤中的复合态酚和水溶性酚与各微生物类群均不存在相关性。在5—10 cm层中,土壤总酚和水溶性酚与总PLFA和细菌群落均呈极显著的负相关关系(P<0.01),且水溶性酚与微生物群落的相关性要高于总酚的。总体上,0—10 cm层土壤中的酚类物质与微生物联系密切,而10—20 cm的深层土中酚类物质并不起主要作用。

表3 四种土地利用方式下不同土层中9种酚酸物质含量/(μg/g)

不同字母代表差异显著(P<0.05)

图2 不同土地利用方式下土壤微生物含量的垂直分布Fig.2 The vertical distribution of soil microbial content under different land uses嵌入的图表示4种土地利用方式下真菌：细菌

图3 土壤总酚、复合态酚和水溶性酚与土壤微生物群落的线性回归分析Fig.3 The linear regression analysis between soil microbial community and soil total phenol, complex phenol, water-soluble phenol respectively

2.4 9种酚酸物质与土壤微生物群落的相关分析

分别对0—5 cm层和10—20 cm层的土壤PLFA与土壤酚酸物质进行冗余分析,把各土层中的9种酚酸物质与微生物群落做偏蒙特卡洛检验,每个土层的两个排序轴均解释了总变异的90%以上,说明这两个排序轴在某种程度上能反映酚酸物质对微生物群落影响的大部分信息(图4)。但不同酚酸物质在不同土层之间的表现不同,其中,在0—5 cm层中,阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸和β-谷甾醇与真菌和F∶B呈显著正相关关系(P<0.05),在10—20 cm层中,β-谷甾醇与F∶B存在显著正相关关系(P<0.05)。

图4 土壤酚酸物质与土壤微生物群落的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of soil phenolic acids and soil microbial communitiesFer.: 阿魏酸Ferulic acid; 2,4-dihy.: 2,4-二羟基苯甲酸2,4-dihydroxybenzoic acid; 7-hycou.: 7-羟基香豆素7-hydroxycoumarin; Abi.: 松香酸Abietic acid; β-sit.: β-谷甾醇β-sitosterol; Ole.: 齐墩果酸Oleanolic acid; Shi.: 莽草酸Shikimic acid; Cin.: 肉桂酸Cinnamic acid; Phl.: 间苯三酚Phloroglucinol

土壤酚酸物质与微生物群落的Pearson相关分析表明,不同种类酚酸物质对土壤微生物群落的影响程度不同,同一种酚酸物质在不同土层之间对微生物的作用也存在明显差异(表4)。其中,在0—5 cm层中,阿魏酸、2,4-二羟基苯甲酸和齐墩果酸与总PLFA、细菌和真菌群落存在显著的正相关关系,且阿魏酸对真菌群落的影响较大(P<0.01);在10—20 cm层中,酚酸物质与微生物群落不存在明显的相关关系,只有β-谷甾醇与F∶B达到显著正相关的水平(P<0.05)。本研究在5—10 cm层的酚酸物质均不显著,且通过冗余分析的结果,10—20 cm层的大部分酚酸并未发挥主要作用。

3 讨论

由于地上植被群落、地表凋落物分解速率和人为活动干扰程度等方面存在差异,土地利用方式改变了固有的土壤微生物群落区系[10,12,27,35-37]。本研究中,0—5 cm层中,SF的总PLFA和真菌含量显著高于FL和AL,而在5—10 cm层和10—20 cm层中则未达到显著水平,而0—5 cm层中,AL的细菌群落含量显著低于SF和LP(P<0.05, 图2),这说明土地利用方式的变化对表层土壤微生物群落的改变有显著作用,而对亚表层土壤则影响较小。Zhang等[38]人研究表明,在次生林向落叶松人工林转变过程中,由于土壤酸化和有效养分含量的降低,土地利用方式对土壤表层(0—10 cm层)微生物群落影响较大。我们发现0—5 cm层中,林地的F∶B显著高于FL和AL(P<0.05, 图2),这可能是与不同土地利用方式下的养分转换和归还、林地的枯枝落叶质量和数量比耕地和荒地高有关,这与众多学者研究结果吻合[26,27,39]。同时,土壤干扰对微生物群落结构有重要的影响,F∶B能快速地对土地管理制度的变化做出快速的反应,其比值越高,生态系统越稳定,同时氮的流失速率降低[40]。Bailey等[39]认为经过耕作的土壤与自然管理或未耕作的土壤相比,有更低的真菌含量。

表4 9种酚酸物质与土壤微生物群落的Pearson相关分析

**P<0.01; *P<0.05

通过植物和草食动物取食等产生的次生代谢物质影响着植物与土壤、地上与地下的交互作用,尤其是影响微生物的代谢活动,酚类物质是土壤中重要的次生代谢产物之一,对土壤中的养分转换和循环以及微生物群落结构产生影响[15,41]。本研究中,0—5 cm层的土壤总酚与土壤总PLFA、细菌和真菌群落均达到显著正相关关系,而5—10 cm层中,土壤总酚和水溶性酚均与土壤总PLFA和细菌群落存在显著负相关关系(P<0.05, 图3),这是因为由于地表凋落物分解作用,表层土壤的酚类物质含量远高于深层土壤的,而土壤酚类物质对土壤有效养分和土壤酶活的变化性有重要作用,进而对土壤微生物群落产生影响[42]。酚类物质能抑制与土壤硝化作用有关的微生物类群,降低土壤硝化作用的强度[43],Blum[44]发现在营养充足的条件下,酚酸容易被微生物利用表现出自毒作用,从而引起土壤微生物数量密度的改变。林地(尤其针叶林)的腐殖层有大量抑制性化合物,降低凋落物分解速率,减缓土壤团聚体矿化速率,土壤中的酚酸物质可以减少微生物生物量和活动,并改变土壤微生物群落结构[42,45]。Souto等[46]发现挪威云杉产生的酚酸化合物对微生物活动具有一定的抑制作用。本研究中,通过将9种土壤酚酸物质与土壤微生物群落的进行冗余分析发现,四种土地利用方式下0—5 cm层中,土壤的酚酸物质与真菌和细菌群落有密切的关系,且阿魏酸和2,4-二羟基苯甲酸等物质对微生物群落结构有显著的影响(P<0.05),但在10—20 cm层中,微生物群落与酚酸物质间的关系并不紧密,只有β-谷甾醇与各微生物类群显著相关(P<0.05, 图4)。Ji等[47]通过向胡桃楸幼苗添加落叶松林地分泌的2,4-二羟基苯甲酸、阿魏酸、香豆素和松香酸的根际和非根际浓度后,发现非根际处理下的微生物量要高于根际处理下的,群落结构也更加丰富,同时7-羟基香豆素+2,4-二羟基苯甲酸+阿魏酸和7-羟基香豆素+阿魏酸处理下的微生物量要显著高于对照。酚酸物质可以显著的影响土壤中微生物的生物量、多样性和群落组成,能够增强某种特定种类微生物的丰富度[46-47]。

4 结论

综上所述,不同土地利用方式下不同种类的酚酸物质含量存在差异,酚酸物质与微生物群落存在密切的关系,相比于10—20 cm层,0—5 cm层土壤真菌和微生物群落结构受酚酸物质作用的影响较大,同时,四种土地利用方式下,0—5 cm层和5—10 cm层的土壤总酚对各群落微生物量的影响分别表现为促进和抑制的作用。我们的研究只关注了在不同土地利用方式下酚类物质和酚酸物质与土壤微生物之间的关系研究,而了解不同土地利用方式下植物碳输入方式的不同对土壤理化性质和地下微生物群落的影响,有利于进一步揭示微生物群落在土地利用方式下的变化机制,因此,未来可开展相关研究来丰富和完善土地利用对微生物群落的影响机制。