基于数据库分析肝细胞癌细胞XPO5基因水平变化及其临床意义*

王 刚，赵洪波，朱亚玲，蒋保三，张越美，刁勇

肝细胞癌（hepatocellular caicinoma，HCC）是世界上第六大癌症和第三大常见的癌症死因[1，2]。XPO5属于核转运蛋白家族，其转运的pre-miRNAs从细胞核向细胞质的输出是miRNA成熟不可或缺的一步。XPO5作为通过调节miRNA来控制基因表达的关键分子，其本身的表达改变或突变对miRNA水平有显着的影响[3]。大量研究证明，HCC的发生发展与miRNA的差异性表达有着密切的关系，甚至相当数量的miRNA直接参与了HCC的分化、凋亡、侵袭和远处转移过程[4]。据文献报道，XPO5表达与前列腺癌和黑色素瘤等肿瘤相关，发现在前列腺癌细胞，敲低XPO5表达可抑制癌细胞增殖和前列腺癌的发展[5]。XPO5过表达导致miRNA加工机制的失调，导致蛋白质稳定性发生变化，这一过程可能是通过较低的泛素化和糖基化而实现的[6]。但XPO5基因与HCC的相关报道还不多，具体作用机制尚不清楚。本研究应用公共数据库分析了HCC细胞XPO5基因水平的变化，并分析了其对患者预后的影响，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 Oncomine数据库分析 Oncomine（https://www.oncomine.org/）数据库[7]为收集和标准化分析肿瘤样本基因表达谱芯片的数据库，能提供肿瘤转录组数据。目前，Oncomine已经收集了来自715个基因表达数据集，86733个癌组织和正常组织的样本数据，用于识别肿瘤基因组中失调的基因、通路和调控网络。Oncomine可以分析多个基因的差异性表达，给出比较全面的结论。从Oncomine数据库中筛选基因，在本研究中设置的检索条件如下：①Analysis type：Cancer vs.Normal analysis；②Cancer type：Liver cancer；③Data type：mRNA；④设定条件：Over-expression；⑤XPO5。分析HCC组织XPO5 mRNA水平。

1.2 基因表达谱互相作用分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn）数据库 由北京大学研制开发用于分析基因在癌组织与正常组织差异表达的在线应用程序[8]。在GEPIA中，数据是基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）和 GTEx（Genotype-Tissue Expression）数据库，得出标准RNA测序数据。在本研究，首先，在GEPIA数据库中选择来源于TCGA数据库的所有HCC和正常组织的RNA测序数据，分析其是否存在差异表达,以验证Oncomine数据库的结论。然后，分析不同临床和病理分级患者该基因的差异及其该基因水平差异对患者总体生存率和无病生存率的影响。

1.3 MethHC（a database of DNA Methylation and gene expression in Human Cancer）数据库分析 MethHC数据库[9]（http：//methhc.mbc.nctu.edu.tw）是关于肿瘤基因表达和DNA甲基化的综合数据库，由台湾国立交通大学开发，包含18种人类肿瘤，包括正常和肿瘤组织DNA甲基化和mRNA/miRNA表达谱。利用MethHC可以探讨正常和肿瘤组织DNA甲基化模式，并分析甲基化和表达之间的关系。我们运用该数据库分析XPO5基因DNA甲基化水平。

1.4 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）数据库分析 STRING（http：//stringdb.org/）是包含各种蛋白质相互作用的数据库[10]。数据来源主要为文献报道的蛋白质相互作用信息以及通过共表达研究、高通量实验和基因组信息分析预测的结果，描述的相互作用关系包括生理上的直接相互作用和功能上的间接相互作用。该数据库为本研究提供了HCC组织XPO5相关蛋白的相互作用的分析资料。

2 结果

2.1 HCC组织与正常肝组织XPO5基因水平的比较 在Oncomine数据库，有Chen Liver（Mol Biol Cell,2002）和 Wurmbach Liver（Hepatology，2007）2个子数据库符合筛选条件。分析发现HCC组织XPO5基因较正常肝组织呈显著高水平（P值为1×5.11-6，图 1A、图 1B）；在 Chen Liver数据库中，有76例正常肝组织和103例HCC组织，后者XPO5基因呈高水平，其中n=179，Fold Change=1.758（P 值为 1×3.80-13，图 1A）；在 Wurmbach Liver数据库中，有10例正常肝组织和35例HCC组织，后者 XPO5基因为高水平，其中 n=45，Fold Change=2.125（P 值为 1×1.02-5，图 1B）。应用GEPIA分析TCGA中HCC数据，包括正常肝组织50例和HCC组织369例。HCC组织 XPO5基因水平较正常肝组织显著升高（P＜0.01，图 2），与Oncomine数据库结果一致。

2.2 XPO5基因水平与HCC患者生存期的关系 利用GEPIA中TCGA数据分析XPO5基因水平与HCC患者生存期的关系，发现了182例XPO5基因高水平与182例XPO5基因低水平患者的生存曲线，显示XPO5基因高水平组总体生存期显著短于低水平组（P＜0.01，图3A），XPO5基因高水平组无病生存期也显著短于低水平组（P＜0.01，图3B）。

图1 Oncomine各子数据库中HCC组织与正常肝组织XPO5 mRNA水平差异

图2 TCGA数据库419个样本XPO5水平（红色为369例HCC，灰色为50例正常肝组织）

图3 XPO5基因水平与HCC生存期的关系

2.3 XPO5基因水平与HCC病理学分级关系 HCC病理学分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级。Ⅰ/Ⅱ级为高分化，Ⅲ/Ⅳ级为低分化。利用GEPIA中TCGA数据分析不同病理学分级的HCC组织XPO5基因水平的差异，结果Ⅲ级HCC组织XPO5水平最高（图4）。

图4 不同病理学分级的HCC组织XPO5水平比较

2.4 XPO5基因主体区域DNA甲基化水平分析 在MethHC数据库中显示XPO5基因甲基化转录模板NM-020750，在HCC中其甲基化水平较正常肝组织低（P＜0.005,图5A）。分析HCC组织XPO5基因在启动子（promoter）区域、增强子（enhancer）区域和基因体（gene body）区域等区域甲基化水平，发现其在基因体区域甲基化水平较正常肝组织显著降低（图5B）。

图5 XPO5基因体区域甲基化水平比较

2.5 XPO5相关作用蛋白网络 利用STRING数据库分析XPO5蛋白的相互作用，其中以XPO5为中心发现有多个相互作用的蛋白质，如RAN、DICER1和ILF3等（图6）。

图6 XPO5蛋白的相互关系

3 讨论

XPO5存在于核膜，介导pre-miRNA的运输，从而调控miRNA的表达。阻止XPO5的表达能导致miRNA水平的减低。XPO5的突变将导致miRNA合成减少，且减少对miRNA靶基因的抑制。有文献报道，Pin1的敲减能恢复XPO5功能和miRNA的合成，从而抑制HCC增殖和迁移。因此，研究XPO5与HCC的关系尤为重要。

我们首先利用Oncomine数据库筛选出在HCC组织呈高水平的XPO5基因，并与正常肝组织进行比较，结果2个子数据集均显示HCC组织XPO5 mRNA水平比正常肝组织高。再选择TCGA数据中369例HCC患者和50例正常人进行分析，结果与Oncomine数据库筛选结果一致。我们又通过MethHC网站分析了XPO5基因在HCC和正常肝组织中的甲基化水平，MethHC分析结果显示在HCC组织XPO5基因在基因体区域甲基化水平比正常肝组织中的低，提示XPO5基因在基因体区域甲基化水平降低可能在HCC的发生和发展过程中扮演着重要的角色。DNA甲基化的主要功能区域包括promoter、enhancer和gene body。这三个区域DNA甲基化对基因转录的影响是不同的，启动子甲基化能抑制转录起始，而转录延伸会增强基因体甲基化，增强子的甲基化更加复杂。研究表明，基因体DNA甲基化可能通过阻断启动子的启动或通过影响转录单元内重复DNA的活性来增加转录活性，这也正好验证了本研究发现的HCC患者癌组织XPO5基因体区域甲基化水平降低的结论，但其具体机制还需要进一步研究。

最后，我们利用GEPIA中TCGA数据库分析了XPO5基因水平与HCC患者癌组织不同病理学分级之间的关系及其对患者生存时间的影响。XPO5基因上的rs11077单核苷酸位点可以改变XPO5的表达，从而影响miRNA的整体表达。已有研究证实 rs11077基因多态性与我国小细胞肺癌、非小细胞肺癌和肝癌等恶性肿瘤患者预后相关。与XPO5基因低水平组相比，XPO5基因呈高水平者总体生存率和无病生存期均明显缩短。HCC分级代表了肿瘤的恶性程度，但是XPO5基因水平却在Ⅲ级患者癌组织最高。由于HCC癌组织分化Ⅳ级比较罕见，可能由于数量较少造成这一结果，具体原因仍需进一步研究和验证。我们还利用STRING数据库分析了XPO5蛋白与其他蛋白的相互作用情况，结果发现RAN、ILF3和DICER1等蛋白与XPO5关系密切。DICER1是miRNA生成的关键酶，是大多数miRNA合成所需要的酶。XPO5基因调控DICER1的表达，而抑制DICER1的表达，使HCC细胞恶性转化和迁移能力显著下降。有研究发现,DICER1缺失与其他致癌因子共同作用加速HCC的发生。有人认为DICER1是一个潜在的肿瘤抑制因子。ILF3蛋白的双链RNA结合域的功能是作为一种奇特的核输出序列，其功能的实现依赖于XPO5的表达。ILF3蛋白家族对病毒感染反应、mRNA的运输与定位、翻译控制、转录和信号转导等方面发挥着非常重要的作用。RAN mRNA及其蛋白在多种肿瘤的细胞系和组织中呈高表达，抑制该基因的表达可以降低肿瘤的发生，并且RAN可调控 HCC相关蛋白有丝分裂在纺锤体的定位。也有研究认为可将RAN蛋白作为治疗HCC的靶标之一。