围手术期应用乌司他丁治疗对肝细胞癌患者肝切除术后外周血Th22细胞百分比和血浆白细胞介素-22的影响*

朱 俊，丁 莹，王世清，张 野，刘 野，刘泽刚

肝切除术是治疗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最有效的方法，但手术应激和术后炎症反应等均可导致肝脏损伤，造成术后肝肾功能异常。有研究发现，在围手术期给予肝切除患者皮质激素或乌司他丁可在一定程度上改善术后肝功能损伤[1，2]，但其机制尚未完全阐明。辅助性T细胞22（T helper 22，Th22）是新近发现的CD4+T细胞亚群，能分泌白细胞介素 -22（interleukin-22，IL-22），并为其主要的效应细胞因子，在机体炎症反应应答过程中发挥重要的作用[3，4]。本研究检测了接受肝切除手术的HCC患者外周血Th22细胞和血浆IL-22水平，为研究乌司他丁调控肝脏炎症的机制假说提供新的试验依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2015年7月～2017年4月解放军昆明总医院普通外科收治的接受肝切除术治疗的HCC患者88例（男62例，女26例；平均年龄为51.3±9.1岁；肝功能Child-Pugh A级47例，B级41例），符合美国肝病研究学会发布的诊断标准[5]，肝脏出现结节＞1 cm，在增强CT或MRI检查时呈典型的“快进快出”征象，即动脉相显示血管丰富，但门静脉期消退；术后经组织病理学检查证实为HCC。纳入标准：年龄＞18岁，Child-Pugh A级或B级，美国东部肿瘤协作组（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）活动状态评分为0分或1分。排除标准：转移性肝癌、术前影像学检查发现存在肝外转移灶、有原发性脑、肾、肺重大疾病和Child-Pugh C级患者。同时，选择30例（男22例，女8例；平均年龄为49.7±12.4岁）年龄和性别相匹配的健康志愿者为对照组。本研究方案已通过解放军昆明总医院医学伦理委员会批准，所有入组人群签署知情同意书。

1.2 治疗方法 在88例HCC患者中，行半肝切除术治疗29例，肝叶切除术治疗49例，肝段切除术治疗10例。所有患者均采用解剖性肝切除术，采用钳夹法断肝，采用Pringle手法阻断第一肝门，控制入肝血流，肝门阻断时间为（41.5±4.6）min。术后常规给予保肝、止血、营养支持、维持电解质平衡等对症治疗。部分患者在术后，给予乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司，国药准字H19990134）30万单位溶于50 ml生理盐水中缓慢静脉推注，3次/d，连续注射7 d；其余患者则不给予乌司他丁治疗。

1.3 血浆IL-22水平和外周血Th22细胞检测 采用ELISA法检测血浆IL-22水平（使用美国R&D公司提供的试剂盒）；使用Sigma公司提供的淋巴细胞分离液和采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），调整细胞数至1×107个/管，冻存于液氮中备检。取1×106个PBMCs，移入FACS管，加入 PMA（终浓度 5 ng/ml）、伊乌诺霉素（终浓度500 ng/ml）和莫能霉素（终浓度 10 ng/ml），于 37℃、5%CO2条件下刺激培养 12 h。洗涤后，加入抗人CD3-APC和抗人CD4-FITC（美国BD Bioscience公司） 各 10μl，4℃避光孵育 20 min，PBS洗涤2次，加入BD Cytofix/CytoPerm溶液200μl，室温、避光孵育 30 min，4℃、500 g 离心 3 min，加BD Perm/Wash缓冲液洗涤2次，加入用Perm/Wash缓冲液稀释的抗人IL-22 PerCP（美国BD Bioscience公司），冰上避光孵育30 min，加Perm/Wash缓冲液洗涤2次，加入含4%多聚甲醛的PBS固定，上FACS Calibur流式细胞仪分析。采用CellQuest Pro软件获取细胞，采用FlowJo8.4.2软件分析，表型为CD3+CD4+IL-22+的细胞为Th22细胞。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0软件进行数据分析。对于符合正态分布的计量资料以（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；对于非正态分布的计量资料以[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 在肝切除术后接受常规治疗者51例，给予乌司他丁治疗者37例，两组患者人口学和临床资料比较，无显著性差异（P＞0.05，表1）。

表1 两组HCC患者人口学和临床资料【%，（±s），M（P25，P75）】 比较

表1 两组HCC患者人口学和临床资料【%，（±s），M（P25，P75）】 比较

常规治疗（n=51） 乌司他丁（n=37）男性 34（66.7） 28（75.7）年龄（岁） 50.8±9.9 53.2±7.1 Child-Pugh A级 26（50.9） 21（56.8）Child-Pugh B级 25（49.1） 16（43.2）半肝切除术 19（37.3） 10（27.0）肝叶切除术 27（52.9） 22（59.5）肝段切除术 5（9.8） 5（13.5）肝门阻断（min） 39.5±3.5 45.1±4.9术中出血量（ml） 420.0（300.0，2800.0） 450.0（250.0，3000.0）肿瘤直径（cm） 4.1（1.2，11.8） 4.8（1.3，12.1）

2.2 两组肝肾功能指标变化的比较 术前，两组血清生化指标无显著差异（P值均＞0.05）；术后3 d和7 d，乌司他丁治疗组血清ALT和AST水平显著低于常规治疗组（P值均＜0.05，表2）。

2.3 HCC患者与健康人外周血Th22细胞百分比和血浆IL-22水平比较 HCC患者外周血Th22百分比显著高于健康人【（1.4±0.3）% 对（0.8±0.1）%，P＜0.0001】，HCC 患者血浆 IL-22水平亦显著高于健康人【（116.9±32.6） pg/ml对（42.1±18.2）pg/ml，P＜0.0001】 。

2.4 两组外周血Th22细胞百分比和血浆IL-22水平比较 术后3 d和7 d，乌司他丁治疗组外周血Th22细胞百分比和血浆IL-22水平显著低于常规治疗组（P值均 ＜0.05，表3）。

表2 两组血清肝肾功能指标【（±s），M(P25，P75)】 的比较

表2 两组血清肝肾功能指标【（±s），M(P25，P75)】 的比较

与常规治疗组比，①P＜0.05

常规治疗（n=51） 乌司他丁（n=37）ALT（IU/L）术前 41.4（23.4，184.1） 42.1（24.1，192.3）术后 3 d 450.6（56.1，820.7） 219.4（40.1，510.9）①术后 7 d 115.4（35.7，625.2） 72.4（25.6，471.5）①AST（IU/L）术前 38.6（19.7，117.3） 40.9（15.1，109.4）术后 3d 257.3（115.3，7265） 108.8（82.5，439.1）①术后 7d 90.5（45.5，293.8） 61.4（29.4，351.4）①TBIL（μmol/L）术前 27.9±5.9 30.1±6.7术后 3d 56.1±8.3 47.7±4.9①术后7d 42.3±7.6 42.4±4.8 BUN（mmol/L）术前 4.2±1.1 4.6±1.1术后3d 4.3±1.2 4.5±1.2术后7d 4.3±0.9 4.5±0.9 Cr（μmol/L）术前 59.2±12.9 63.6±9.9术后3d 60.7±9.9 66.6±8.7术后7d 66.9±10.9 60.3±7.9

表3 两组外周血Th22细胞（%）和血浆IL-22水平（±s）比较

表3 两组外周血Th22细胞（%）和血浆IL-22水平（±s）比较

与常规治疗组比，①P＜0.05

常规治疗（n=51） 乌司他丁（n=37）外周血Th22细胞术前 1.4±0.3 1.3±0.3术后3 d 1.3±0.2 1.2±0.4术后 7 d 1.3±0.2 1.1±0.3①血浆 IL-22（pg/ml）术前 119.3±34.2 113.5±30.4术后3 d 109.7±29.8 98.1±20.1术后 7 d 110.7±37.1 94.1±24.8①

3 讨论

由于术中肝脏血流阻断和第一肝门开放造成的缺血/缺氧和再灌注，导致肝脏损伤和明显的肝功能异常。同时，绝大多数HCC患者均罹患慢性肝脏疾病，如病毒性肝炎、肝硬化等，手术应激所致的炎症介质释放不但可加重肝功能损伤，还能造成肾脏、心脏、中枢神经系统等多脏器功能不全[6]。乌司他丁是尿胰蛋白酶抑制剂，可清除氧自由基、抑制炎症介质释放，改善免疫细胞功能，具有较强的抗炎效果，在多种危重症患者治疗中均可发挥保护肝、肾功能的作用[7-9]。本研究发现，两组HCC患者接受肝切除术后第3天血清转氨酶水平有所升高，至术后第7天有所下降。但乌司他丁治疗组在术后第3天和第7天血清转氨酶水平均显著低于常规治疗组，但血清TBIL水平在两组未见明显差异，一方面说明HCC患者接受肝切除术的安全性较高，绝大多数患者未发生严重的肝细胞损伤；另一方面说明乌司他丁能改善患者术后肝功能状态，有利于患者术后恢复，与既往在肝脏围手术期应用乌司他丁治疗的结果一致[2，9]，可能与乌司他丁在一定程度上能抑制机体炎症应答有关[10-12]，但其中的机制仍有待进一步研究。

Th22细胞是一类新发现的CD4+T细胞亚群，主要分泌IL-22和肿瘤坏死因子-α，但不表达IL-17和干扰素 -γ[3，13，14]。IL-22 是 Th22 细胞最主要的效应细胞因子，而IL-22在多种疾病发病过程中根据其表达部位和表达量的不同可发挥促进炎症应答和保护细胞免受损伤的双重作用[15]。Th22细胞及其分泌的IL-22在乙型肝炎病毒感染[16]、丙型肝炎病毒感染[17]、药物性肝损害[18]和慢加急性肝衰竭患者[19]水平均明显升高。动物实验亦证实Th22细胞和IL-22在肝脏疾病发病过程中主要发挥促进炎症应答的作用[11]。IL-22还可促进肝癌细胞的增殖[20]，Th22细胞亦与HCC的发生发展密切相关。本研究发现，HCC患者外周血Th22细胞百分比和血浆IL-22水平显著高于健康人，与既往的研究结果一致。加用乌司他丁治疗的HCC患者在接受常规肝切除术治疗后血Th22细胞和IL-22水平降低，可能与乌司他丁能抑制炎症应答反应有关，结合乌司他丁能降低血清转氨酶水平而表现出的肝脏保护作用，我们认为乌司他丁可能抑制了Th22细胞应答。