自体外周血干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者疗效及安全性分析

赵芳芳，翟永贞，冯国和

我国最常见的导致肝硬化的病因为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染[1，2]。在乙型肝炎肝硬化的早期，通常由于肝脏处于代偿期而无明显的症状，但随着病情进展，肝脏功能失代偿而出现各种并发症，预后极差[3]。除护肝、抗病毒和对症治疗外，肝移植是治疗终末期肝病的唯一根治手段，但多种因素制约其发展[4-7]。近年来，随着再生医学的兴起，干细胞因其具备多向分化潜能、促进肝脏自我更新、减轻肝脏免疫损伤和纤维化等作用而备受关注[8]。干细胞移植已经成为有前途的治疗肝硬化的方法。常用的干细胞通常来源于脐带、骨髓、肝本身或外周血，其中自体外周血干细胞（autologous peripheral blood stem cells，PBSCs）具有来源方便、无排斥反应、操作简便、成本低等优点[9-11]，将PBSCs直接注入肝固有动脉是常用的移植方法[12]。目前，关于自体外周血干细胞移植（autologous peripheral blood stem cells transplantation，APBSCT）治疗肝硬化的可行性研究尚不全面。本研究采用APBSCT治疗乙型肝炎肝硬化患者，观察了疗效及其安全性情况，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 2014年3月～2016年2月本院感染病科收治的乙型肝炎肝硬化患者100例，男78例，女22例；年龄35～60岁，平均年龄为（42.2±4.5）岁。符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年更新版）的诊断标准[13]，Child-Pugh B 级 44例，Child C级56例，平均评分（10.5±2.4）分。排除标准：①肝癌或其他肿瘤患者；②血清肌酐 ＞132.6 μmol/l、存在肺和心脏疾病者；③合并丙型肝炎病毒（HCV）或人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者；④有肝内外胆道梗阻性疾病证据，如原发性硬化性胆管炎或超声波检查见胆总管扩张；⑤多普勒超声检查见有肝静脉、门静脉或脾静脉栓子形成；⑥有严重的消化道出血和腹腔感染者；⑦妊娠。本研究获得医院医学伦理委员会批准，所有入选患者均签署书面知情同意书。

1.2 APBSCs的采集和分离 给予患者重组人粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF，白特喜，山东科兴生物制品有限公司）300 μg皮下注射，连续4 d。检测外周血白细胞计数。当外周血白细胞≥10.0×109/L，单核细胞≥1.0×109/L时，满足干细胞采集条件。使用美国Spectra血细胞分离机采集PBSC悬液约150 ml。在采集过程中，监测血压和心率，给予患者口服或注射碳酸氢钙，以避免柠檬酸反应引起低钙血症而导致的口周麻木、手足抽搐等。自机采袋中取样，用电子血细胞计数器计算有核细胞总数。当监测到CD34+干细胞计数占单核细胞比例≥0.5%时，使用流式细胞仪进行分离，保证每次分离的 CD34+干细胞数量不少于（2～4）×106cells/ml。

1.3 APBSCT的实施 将患者分成两组，其中一组在我院放射介入科接受细胞移植治疗。具体过程如下：局部麻醉，行右侧股动脉穿刺，将导管通过降主动脉、腹主动脉置入肝固有动脉。当肝固有动脉显影后，将PBSC悬液100 ml缓慢注入肝固有动脉。术后拔管，穿刺点局部加压包扎，患肢制动6 h，卧床24 h。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件进行分析,计数资料比较采用 x2检验；计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不良反应 所有患者均对治疗方案耐受，未出现血栓形成、出血或明显的肝功能恶化。与注射rhG-CSF相关的主要不良反应为低热、肌肉骨骼疼痛、疲倦，其他症状轻微。随着停药，症状消失。除1例患者出现轻微的口周麻痹，给予减慢采血速度并给予补钙后，症状缓解外，其余患者均安全度过白细胞采集期而无并发症发生。随访期间，两组发生上消化道出血、自发性细菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis，SBP）、肝性脑病等肝硬化并发症的数次和进展为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的例数方面无明显差异。其中1例（5%）移植组患者在移植后4个月时出现HCC，经介入治疗6个月后死亡。另外1例（5%）移植组患者在移植后6个月时出现肾上腺肿块，原因未明；2例（10%）对照组患者在随访过程中发生HCC。

2.2 两组肝功能指标变化的比较 在移植后6 m，移植组血清ALB水平显著高于，而Child-Pugh评分显著低于对照组（P＜0.05，表1）。

3 讨论

近年来，干细胞的潜能、属性、可用性和风险在国内外被反复报道[14，15]。过去十余年临床干细胞移植方面的初步经验为干细胞疗法可以有效治疗某些肝脏疾病提供了证据。近年来的研究发现，间充质干细胞可通过对造血干细胞（hematopoietic stem cells，HSCs）施加多种协同性影响而减少在肝组织重塑过程中的炎症和纤维化程度[16]，而动物实验证实纯化的干细胞能转化为肝细胞，减少肝脏损伤导致的致命性肝衰竭的发生[17]。

表1 两组肝功能指标（±s）比较

表1 两组肝功能指标（±s）比较

与对照组比，①P＜0.05

例数 TBIL（μmol/L） ALB（g/L） INR Child-Pugh评分移植组 术前 50 59.2±10.8 30.3±2.7 1.4±0.8 10.5±2.4术后1 m 50 34.5±17.2① 35.3±3.2① 1.2±1.3 8.2±2.3术后 3 m 49 57.6±15.1 31.0±3.8 1.1±0.9 8.5±5.3术后 6 m 47 63,7±18.4 30.6±4.4① 1,5±0.3 8.4±2.1①移植组 术前 50 58.3±21.1 31.4±3.3 1.3±2.0 9.1±5.5术后 1 m 49 59.3±12.8 30.2±1.5 1.3±11 9.5±4.8术后 3 m 47 62.6±15.3 30.0±2.2 1.4±0.6 9.2±3.0术后 6 m 46 67.3±16.7 27.6±1.9 1.6±1.5 9.7±3.3

在外周血中，以CD34+为主要标记的干细胞在组织损伤后血管再生过程中发挥重要作用[18]。临床研究亦证实CD34+细胞水平在肝切除术后显著增加[19]。因此，自体外周血CD34+的干细胞移植有可能改善肝硬化患者的肝功能及逆转肝组织学改变。本文通过病例对照研究评估了失代偿期乙型肝炎肝硬化患者在APBSCT治疗后的安全性和可行性，同时通过分析肝脏生化指标、Child-Pugh评分、随访患者生活质量等指标评估了干细胞移植的效果。

所有患者对rhG-CSF动员均有效果，有明显的白细胞计数增加，但干细胞的产量仍低于那些健康的捐赠者[20]。大部分患者在白细胞分离时耐受良好，只有少数出现结果中提到的副反应，与已报道的关于酒精性肝硬化患者注入外周血干细胞的安全性和有效性的初步研究结果一致[21]。移植组在自体PBSCT后1个月TBIL显著下降，后几个月里无明显变化，但仍有患者在移植后3个月时和6个月时血清胆红素继续下降，与既往报道的接受自体PBSCT患者血清总胆红素改善的结果一致[22]。血清肝脏酶类水平的下降与炎症过程的降低相平行，也应该在干细胞移植前后有所变化。在APBSCT后1个月，移植组患者血PT或INR均有显著改善，但与对照组之间无显著性差异，提示随着自体PBSCT后肝脏炎症的减轻，肝脏的凝血功能有短暂的改善不持久。

由于干细胞具有再生能力，实验研究证实其能在肝脏环境下转化为肝细胞[23]。所以，理论上来说可以观察到肝脏体积的增大。但整个随访观察期进行的腹部超声检查显示移植组在APBSCT前后肝脏大小无显著性变化，与对照组比也无显著性差异，可能是由于患者处于肝硬化阶段，肝脏体积的变化已经难以观察到，或许提示如果在肝硬化早期进行APBSCT治疗可能效果更好。还有可能由于腹部超声在检测肝脏大小的微小变化方面能力有限。虽然CT和MRI检查更灵敏，但价格相对昂贵，不利于随访观察[24]。

G-CSF注射可以引起外周血干细胞捐献者和血液肿瘤患者脾脏增大[25]。理论上来说，脾肿大者应用G-CSF，尤其是肝硬化患者，也会增加脾功能亢进的风险。因此，入选的移植组患者脾脏长径在16～22 cm之间，明显肿大者被排除。事实上APBSCT后脾脏大小无显著变化。在既往国内外的研究中，健康捐献者在G-CSF动员后其脾脏体积增加的中位值显著高于血液肿瘤患者[26]，可能在慢性脾肿大时脾脏弹性相对减小，G-CSF刺激不会引起其体积的突然变化。相反，如果之前脾脏体积正常，那么可能会在短期内显著增大，从而增加脾功能变化的可能性。

另外，应用腹部超声检查对腹水量进行临床评估，发现移植组在自体PBSCT前后或两组之间腹水量均无统计学差异性变化。可能由于腹水形成的病理生理机制复杂，不易在短期内改变。关于Child-Pugh评分，移植组APBSCT后1个月有显著的下降，其中4例患者在整个随访调查期均有持续的下降，另5例患者也有持续下降超过3个月。尽管两组之间无显著性差异，但在随访期间，移植组Child-Pugh评分一直在下降。

本研究中，所有的移植组患者生活质量均有所提高，尤其是在APBSCT后前3个月，可能与肝脏功能的改善有关。通过两组对比，我们还发现APBSCT并未明显影响肝性脑病、上消化道出血和SBP的发生，而移植组食管静脉曲张分级也无明显改善（资料未列出）。1例移植组患者在4个月后发现HCC，而另1例患者在6个月后出现肾上腺包块。对照组2例患者在随访调查期内确诊为HCC。5例患者在APBSCT后第1年出现呕血或肝性脑病而死亡，而对照组6例患者在随访观察期的第1年内死亡，两组之间病死率无显著性差异。

综上所述，我们可以发现在乙型肝炎肝硬化患者进行APBSCT治疗是安全、可行的，且能有效地改善其生活质量和肝功能指标。