OPO植物乳脂粉与幼儿粪便微生物体外互作益生效果评价

侯爱香，李珂，肖愈，李宗军

(湖南农业大学a.食品科学技术学院；b.食品科学与生物技术湖南省重点实验室；c.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，长沙410128)

0 引言

OPO被作为一种显著有效的功能成分被广泛添加到婴幼儿配方乳粉中，通常以OPO乳脂粉的形式添加，用棕榈油和酶制成富含OPO（40%）的植物乳脂油，然后加入乳糖等成分，经乳化、干燥，制成粉剂，即富含OPO的植物乳脂粉（简称OPO乳脂粉）。对照国家食品安全标准GB1488-2012年食品营养补充使用标准，婴幼儿配方奶粉OPO的添加量为24～96 g/kg，在此范围内，多少浓度的OPO能更好的促进益生菌的生长并未明确。本研究以24月龄幼儿的粪便为菌源，研究不同浓度OPO乳脂粉24 h体外发酵过程中主要肠道微生物的变化情况，对双歧杆菌、总厌氧菌、拟杆菌、梭状芽孢杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌和总需氧菌进行计数，并计算对应的益生元指数PI和B/E值，评价不同浓度OPO-P的益生效果。

1 实验

1.1 材料

OPO乳脂粉（OPO-P）：又称富含OPO的植物乳脂粉，其中有质量分数50%植物精炼油（该植物精炼油为含有质量分数40%的OPO棕榈油）；乳糖质量分数为41.63%；蛋白质质量分数为4.21%；水份质量分数3.72%；稳定剂、乳化剂、维生素、和矿物质等成分合计为0.44%。

粪便样选择主要参考文献[1-2]中方法。选择断奶半年，均未食用OPO配方奶粉的24月龄3名幼儿为志愿者，幼儿2月内未服用抗生素，无肠道病史，采集3名志愿者的新鲜粪便。

含氮基础发酵液为空白对照的基础发酵液，其配方如下[3]：1 L水中含2 g酵母粉，2 g蛋白胨，2 g NaHCO3，4 m L质量浓度为0.025 g/100 m L的刃天青，2 m L吐温-80，0.5 g胆汁酸盐，0.5 g L-半胱氨酸，0.l g N aC l，0.05 g氯化血红素，0.04 g K2HPO4，0.01 g M g-SO4-7H2O，0.01 g CaC l2.7H2O，10μL VK。

传统培养技术采用的选择性培养基：计数总厌氧菌的培养基为W ilkins and Chalgren琼脂[4]；计数双歧杆菌的培养基为BBL培养基[5]；计数乳杆菌的培养基为R ogosa培养基[6]；计数梭状芽孢杆菌的培养基为Sulfite-polym yxin-milk琼脂[7]；拟杆菌用拟杆菌矿物盐琼脂计数[8]；肠杆菌用紫红胆盐葡萄糖琼脂计数[9]；总需氧菌用营养琼脂计数[10]。

1.2 仪器与设备

TP-213分析天平，SP500高压蒸气灭菌锅，SW-CJ-2D超净工作台，YQX-I厌氧培养箱，SPX-250B-Z恒温生化培养箱，C-1厌氧产气袋，C-43圆底立式培养袋，旋涡振荡器，XK 97-A菌落计数器。

1.3 方法

1.3.1 菌源处理

将所取粪便样在厌氧操作箱中迅速解冻，将baby1，baby2和baby3粪样各取10 g混匀，记为mixbaby，将mixbaby加入90 m L PBS缓冲液(pH=7.0)中稀释，加无菌玻璃珠涡旋振荡，使粪便充分分散。稀释后的粪液用4层无菌纱布过滤，除去滤渣，取稀释后的滤液为菌源，整个处理过程在1 h内完成。

1.3.2 OPO乳脂粉的厌氧发酵

通过查阅乔来艳[11]和XinZhang[2]等人做体外发酵研究的文献，将他们所用的体外发酵方法进行改进，用于OPO乳脂粉对人体肠道微生物的影响研究。在37℃条件下，模拟人体肠道环境，配置对照组基础发酵液和实验组OPO乳脂粉发酵液，加入采集处理好的菌源，进行间歇式静态厌氧发酵24 h，监测各发酵阶段（0，4，8，12，24 h）微生物指标，对总厌氧菌、拟杆菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、乳酸杆菌、肠杆菌和总需氧菌进行计数。

将菌源按接种量10%的量，分别加入空白组发酵液和实验组发酵液中。研究以含氮基础发酵液为空白组，以添加了不同浓度OPO-P的发酵液为实验组。其中实验组OPO的添加量参考国家食品安全标准GB1488-2012年食品营养补充使用标准“婴幼儿配方奶粉OPO的添加量为24～96 g/kg”的要求，再结合实际冲泡奶粉时，一般常用的稀释比为4.5 g奶粉兑30 m L水，分别以国标上限96 g/kg，中间质量分数50 g/kg和下限24 g/kg的添加量，在含氮基础发酵液中加入OPO植物乳脂粉为实验组，结合稀释比在发酵液中折算成OPO的质量浓度，分别为3.6，7.5，14.4 m g/m L，分别记为3.6 m g/m L组，7.5 m g/m L组，14.4 m g/m L组。将空白组和各浓度实验组发酵液分别分装在Hungate厌氧滚管，置于37℃厌氧培养箱中发酵，所有试验都进行3次生物学重复。

1.3.3 微生物检测计数

参考Palfram an等人[12]和江南大学赵兰涛[13]所用的肠道微生物计数方法，用传统的稀释平板法，选取合适梯度稀释液100μL均匀涂布在7种选择性培养基上。涂布后总厌氧菌、拟杆菌、双歧杆菌和梭状芽孢杆菌在37℃厌氧培养48～96 h后分别计数；乳酸杆菌、肠杆菌和总需氧菌在37℃,培养48 h后分别计数。

1.3.4 益生元指数计算

评价肠道菌群是否正常、平衡的重要指标有益生元指数，众多研究者采纳Palfram an等人的计算方法[12]，其计算公式如下：

式中：T，Bif，L，Bac，C分别指取样时发酵液中总菌数、双歧杆菌数、乳酸杆菌数、拟杆菌数、梭状芽孢杆菌数量和接种时发酵液中总菌数、双歧杆菌数、乳酸杆菌属、拟杆菌数、梭状芽孢杆菌数量的比值。

1.3.5 B/E值的计算

B/E值为肠道内双歧杆菌和肠杆菌数量之比，计算公式为B/E=Bif/Ent。

1.3.6 数据处理

研究所有试验均进行3次生物学重复，每个样品进行了3次测定，数据通过Excel 2013软件完成统理，结果以SPSS.21.0软件的单因素分析方法（ANOVA）进行显著性分析，两两比较采用最小差异法（LSD）,检验性水准a=0.05。

2 结果与分析

2.1 双歧杆菌和乳杆菌变化结果

双歧杆菌和乳酸杆菌通常作为肠道微生物有益菌的代表，通过添加不同质量浓度的OPO-P进行24 h体外发酵，将两类菌的计数结果列表，如表1所示。

表1 体外发酵过程中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量统计结果 cfu·m L-1

表2 体外发酵过程中拟杆菌、梭状芽孢杆菌和肠杆菌的数量统计结果 cfu·m L-1

由表1可以看出，所有发酵液，双歧杆菌数都存在先上升后下降的趋势。3个不同浓度OPO-P的添加，都能促进双歧杆菌的生长繁殖，在发酵的前8 h内，双歧杆菌数量与OPO-P的添加量成正比，添加的OPO-P浓度越大双歧杆菌的数量越多，在发酵8 h的时候各组发酵液的双歧杆菌数都达到最大值；在8～24 h的发酵阶段，所有发酵液中双歧杆菌数量都呈不同程度的下降，14.4 m g/m L浓度组发酵液中双歧杆菌数下降幅度最大。3个不同浓度OPO-P的添加，都能大幅度的促进双歧杆菌的生长繁殖，但促进作用与OPO-P的添加量没有表现出特定的量效规律。同时，0 h的乳酸杆菌初始菌数水平较为一致，没有显著性差异。添加了OPO-P的3个发酵液乳酸杆菌数均呈先上升后下降趋势，各组发酵液乳酸杆菌数均在12 h时达到最大，3个添加了OPO-P的发酵液在发酵前12 h内呈线性上升趋势，12 h之后，均呈不同程度的下降趋势，3.6 m g/m L组乳酸杆菌的下降幅度略大于14.4 m g/m L组和7.5 m g/m L组；但空白基础发酵液整个发酵过程乳酸杆菌数均呈递减趋势。3个不同浓度OPO-P的添加，都能促进乳酸杆菌的生长繁殖，但促进作用没有表现出特定的量效规律。

2.2 拟杆菌和梭状芽孢杆菌变化结果

拟杆菌、梭状芽孢杆菌和肠杆菌通常作为肠道菌群中无益菌群的代表，通过添加不同浓度OPO-P进行24 h体外发酵，三类菌计数结果如表2所示。

由表2可以看出，拟杆菌、梭状芽孢杆菌和肠杆菌的菌数初始水平在各组中均无显著性差异，拟杆菌和肠杆菌在4 h阶段，各组发酵液菌数水平也无明显差异。但后期发现，OPO-P对拟杆菌和梭状芽孢杆菌均有一定的抑制作用，空白基础发酵液这两菌各阶段的数量均高于实验组发酵液，但抑制作用与OPO-P添加量没有明显的量效规律。OPO-P的添加在整个发酵过程中对肠杆菌数量没有表现出一致的抑制或促进作用，在4 h和8 h阶段，能促进肠杆菌的生长繁殖，之后呈现抑制作用，使肠杆菌数量呈不同程度的下降。

2.3 总厌氧菌与总需氧菌的变化结果

肠道微生物包括厌氧菌和需氧菌，通过添加不同质量浓度的OPO-P进行24 h体外发酵，将两类菌的计数结果列表，如表3所示。

由表3可以看出,体外发酵24 h的过程中，所有发酵液中总厌氧菌数量与时间呈正相关，随着时间的延续不断递增，且发酵前8h阶段的递增速度大于后期，添加了OPO-P的试验组均高于空白的基础对照组，添加量对总厌氧菌数量影响没有明显的量效规律。所有发酵液的总需氧菌总体呈上升趋势，但在前8 h时呈线性上升趋势，并在8 h时总需氧菌数量达到最大，8 h后呈不同程度的下降趋势。

2.4 OPO-P添加量对PI值的影响

由于各个实验组不可避免的有接种不均匀和初始菌数不一致的情况，单独通过对各类菌群不同发酵时间段的菌落数进行比较来衡量营养素的益生作用存在偏差。因此，21世纪初Palframan等人提出了益生元指数PI，他们通过比较PI值的大小，定量描述试验中各类低聚糖的益生效果。本研究借鉴使用PI指标，用以评价不同质量浓度OPO-P与婴幼儿肠道微生物互作的益生作用。

表3 体外发酵过程中总厌氧菌、总需氧菌的数量统计结果 m L-1

由图1可以看出，基础发酵液空白组的PI值为负，不呈现益生作用。添加了不同浓度OPO-P的试验组的益生元指数PI，都呈先上升后下降趋势，且均在8 h阶段达到最大值，说明3个质量浓度OPO-P的添加，都有明显的益生作用，分批一次培养过程中，都在8 h阶段益生效果最好。综合比较，发现各时间段益生元指数最高的一组均为7.5 m g/m L组，以此评判该组益生效果最好，并在8 h阶段PI值最大，达到2.73。研究中，益生效果与OPO-P的添加量不成严格的正比关系。这结果与微生物计数中双歧杆菌数和乳酸杆菌数的结果并不完全一致。在双歧杆菌计数过程中，由表1可以看出，发酵8 h阶段，14.4 m g/m L组的双歧杆菌数量最多，发酵12 h和24 h阶段，14.4 m g/m L组的乳酸杆菌数量最多，但在图1中PI在8,12 h和24 h阶段都是7.5 m g/m L组最大，因为PI值还与这些时间段的拟杆菌数和梭状芽孢杆菌数相关。

图1 不同质量浓度OPO-P的益生元指数（PI）

图2 不同质量浓度OPO-P的B/E值

2.5 OPO-P添加量对B/E值的影响

借鉴Van Der W aaij等以将B/E值作为肠道菌群定殖抗力指标的研究，本研究用B/E值反映幼儿肠道菌群结构，作为益生效果评价的补充指标。将表1中双歧杆菌数量和表2中肠杆菌数量带入计算公式，得B/E值如图2所示。

若B/E＞1，表示肠道菌群中双歧杆菌的水平高于肠杆菌科的水平；若B/E≤1，则表示肠道菌群中双歧杆菌的水平低于肠杆菌科的水平，B/E越大说明肠道菌群越平衡，定殖能力越强，相应的益生效果越好。由图2可以看出，空白组的B/E值在发酵的各个阶段都小于添加了OPO-P的试验组，说明没有添加OPO-P的基础发酵液体系中双歧杆菌没能迅速形成优势菌。但在添加了OPO-P的所有实验组中，B/E值都远远大于1，说明粪便样品作为菌源，在发酵过程中双歧杆菌迅速成为优势菌，占有明显的优势地位，均显示出明显的改善肠道菌群的作用。但这种益生效果与OPO-P浓度的量效关系不固定，在0～8 h阶段14.4 m g/m L组的B/E值最大，表现的益生效果最好，而最后12～24 h的阶段7.5 m g/m L组的B/E值最大，表现出最好的益生效果。

3 讨论

3.1 肠道微生物的检测

本研究采用的传统培养技术对肠道微生物中典型的有益菌、无益菌进行培养计数。传统培养方法，设备要求简单，实验操作技术要求不高，试验成本不贵，试验周期也不长，数据直观，数据处理简单，是很多研究肠道微生物的学者经常采用的方法[14]。赵敏[15]、李艳莉[16]和曾艳华[17]等人先后用传统培养技术研究了山莱英-熟地黄药对与肠道菌群的相互作用、低聚糖对婴儿肠道菌群的益生功能和中性大蒜果聚糖调节肠道菌群功能。但是这种方法也有很多局限，一是能培养的微生物种类有限，肠道微生物的类群多样，不能准确的反映肠道菌群的真实情况；二是只能对样品体系中的活菌进行计数，数据有所遗漏。因此，本研究中厌氧培养的拟杆菌、双歧杆菌和梭状芽孢杆菌的总数并不等于测得的总厌氧菌数，需氧培养的乳酸杆菌和肠杆菌之和也不等于测得的总需氧菌数。再此基础上，为克服传统培养技术的缺陷，有研究者改良肠道微生物计数的方法，如谢旻皓[18],张鑫[19]Vernazza[20]和Sánchez-Patán[21]等人采用FISH(fluorescence in situ hybridization)计数技术，来检测肠道菌群的变化情况。随着微生物检测技术的发展，越来越多的研究者采用高通量测序的方法研究肠道微生物[22-23]。吴根梁[24]等人采用Illum ina M iSeq平台高通量测序研究茶多酚对肠道微生物的组成、多样性的影响，M inhao X ie等人[25]，利用16S rRNA高通量测序研究苦丁茶的有效成分二咖啡酰奎宁酸体外发酵对肠道微生物的影响；陈蕾[26]等人通过传统培养技术之后进一步采用PCR-TGGE技术检测苦荞对肠道微生物多样性的影响。因此，可以借鉴现代测序技术进一步研究OPO-P或OPO对幼儿肠道微生物的影响作用。

3.2 益生效果的评价

双歧杆菌，乳酸杆菌通常作为肠道微生物中的有益菌，肠杆菌、梭状芽胞杆菌和拟杆菌通常会被认为是无益菌，某种物质若能促进双歧杆菌或乳酸杆菌的大量生长，或能抑制肠杆菌、梭状芽胞杆菌和拟杆菌的生长，通常会被认为具有益生效果，能够调节肠道微生物，促进肠道菌群平衡，彭春喜[27]，张宁[28]等人先后采用这种方法评价膳食纤维和大蒜果聚糖的益生功效。但这种方法无法避免接种不均匀、初始菌数不一致和体系中总菌数存在差异的实际问题，且无法确定营养素对有益菌的促进作用是否大于对无益菌的抑制作用，有益菌是否形成优势菌定殖于肠道。因此，研究者们以B/E值、PI值等指数来评价益生效果，如Palfram an等人[12],用PI值评价低聚果糖的益生效果，赵兰涛等人[13],以PI值评价全谷物对肠道菌群的益生作用，Van Der W aaij等人[29],用B/E值衡量益生效果。此外，曾艳华[17],改良Palfram an等人的计算方法，利用益生元活性分数来衡量益生效果，其计算公式如下：“益生元活性分数=[(24 h益生元培养基中的益生菌-0h益生元培养基中的益生菌)/(24 h葡萄糖基础培养基中的益生菌-0h葡萄糖基础培养基中的益生菌)]-[(24 h益生元培养基中的肠杆菌-0h益生元培养基中的肠杆菌)/(24 h葡萄糖基础培养基中的肠杆菌-0h葡萄糖基础培养基中的肠杆菌]”。其计算公式中的益生菌以双歧杆菌和乳酸杆菌来计算，肠杆菌以大肠杆菌和肠球菌来计算。

此外，大量肠道微生物与膳食因子互作的研究通常还以代谢产物短链脂肪酸以及乳酸作为衡量膳食因子益生效果的指标之一。以增加短链脂肪酸产量特别是丁酸、乳酸产量，改变肠道p H值，作为益生指标，如Jelena Vu levic等人[30]，则将代谢产物乳酸纳入影响因素，以益生元效果指数（M easurement of prebiotic effect M PE）来计算益生效果。本研究虽然结合了微生物计数、PI值和B/E值进行益生效果评价，还可以结合更多合适的指标进行进一步评价。

4 结论

本研究通过对肠道微生物中传统的有益菌和无益菌进行分别计数，并结合益生元评价指标PI值和B/E值评估了国标范围内不同质量浓度OPO-P的益生效果，两者结合，比采用单一评价方式得出的结论更准确。研究发现不同质量浓度OPO-P都能有效调节肠道菌群，但7.5 m g/m L组益生效果最好，为婴幼儿配方奶粉中OPO-P的高效添加提供了基础研究数据。但本研究采用传统培养技术对微生物进行计数有一定的局限性，益生效果评价的指标也有限，要获得OPO-P或OPO益生效果更全面的评价，一方面可以采用高通量测序技术对微生物数量变化进行监测分析，另一方面还可以结合肠道微生物的p H值环境，短链脂肪酸、有机酸等代谢产物的产量和种类等指标进行更全面的评价。