植物生长调节剂对草石蚕愈伤组织和不定芽诱导的影响

(贵州大学农学院， 贵阳 550025)

草石蚕(StachyssiebordiiMiq.)属唇形科水苏属植物[1]，是我国的特色蔬菜之一[2]，江苏、重庆、甘肃、贵州等省区均有种植[3]。草石蚕为我国创汇蔬菜，含有丰富的水苏糖[4]，并富含蛋白质、氨基酸和维生素等营养物质；经盐渍、酱制加工后风味独特，为佐餐之佳品[5]；在保健食品和药用开发利用方面前景十分广阔[6-7]。

草石蚕为无性繁殖[8]，在长期的无性繁殖过程中，易感染多种病毒，造成种性退化。组织培养不仅可以解决以上问题，而且还可以提纯复壮[9]。遵义务川草石蚕为贵州优质品种，但在长期栽培中存在种性退化问题，严重影响当地草石蚕产业的发展。草石蚕组培快繁方面的研究较少，且研究不够深入[10-12]。为系统研究其组培快繁技术，针对草石蚕愈伤组织诱导和不定芽分化进行了研究，旨在加快繁殖速度，提高繁殖率，为加速草石蚕优良种质繁育和推广步伐奠定基础，对进一步研究草石蚕脱毒苗的快繁有重要的理论和实践意义。

表1 植物生长调节剂对茎段愈伤组织诱导的影响

序号NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈伤诱导率/ % 鲜重/g 干重/g 愈伤颜色、质地长势10.00.00.00.00Ef0.000Jj0.0000Fg无无20.02.00.516.25De0.049GHIefg0.0175BCDcd浅绿色颗粒++30.04.01.510.00De0.051GHIfg0.0171BCDcd褐色质密+40.06.02.515.00De0.063FGHIefg0.0072DEdef绿色质密+50.20.00.51.25De0.021HIgi0.0020Ef褐色质密+60.22.00.066.25BCbcd0.071EFGHdef0.0178BCDcd绿色颗粒++70.24.02.571.25BCcd0.104CDEcd0.0183ABCbc绿色颗粒++80.26.01.562.50Cd0.084EFGde0.0144CDEde褐色颗粒++90.40.01.50.75De0.046GHIgi0.0078DEef褐色质密+100.42.02.583.75ABCabc0.086EFGcd0.0138CDEde浅绿色颗粒++110.44.00.091.25ABab0.139ABCb0.0208ABab浅绿色质密++120.46.00.577.50BCbc0.159Aa0.0252Aab褐色颗粒+130.60.02.56.25De0.012Hi0.0064DEef褐色质密+140.62.01.588.75ABabc0.125BCDbc0.0201ABab浅绿色质密+150.64.00.588.75ABabc0.147ABb0.0267Aab绿色质密++160.66.00.096.25Aa0.153Aa0.0270Aa浅绿色颗粒+++

注：表中同列不同大写字母表示p<0.05；不同小写字母表示p<0.01。下同。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为贵州省务川仡佬族苗族自治县主栽草石蚕品种。

1.2 方 法

1.2.1愈伤组织诱导

选择长势良好幼嫩的草石蚕叶片和茎段，用75%乙醇浸泡2 s，再用1% NaClO溶液消毒10 min，用无菌水漂洗3～4次。将已灭菌的叶片(切成1 cm × 1 cm方块)和茎段(约0.8 cm)接种到不含激素的MS培养基上，暗培养4 d后接种到MS + NAA 0、0.2、0.4、0.6 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、0.5、1.5、2.5 mg·L-1的培养基上，进行三因素四水平 L16(43)的正交试验设计，研究培养基中6-BA、NAA和GA3对愈伤组织诱导的影响。每个处理接种80个外植体，3次重复。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的条件下培养40 d后，统计愈伤组织诱导率及生长状况。

1.2.2不定芽诱导

称取长势良好一致的0.3 g愈伤组织接种到MS+NAA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、1、2、3 mg·L-1的培养基上，进行三因素四水平 L16(43)的正交试验设计，研究培养基中6-BA、NAA和GA3对不定芽诱导的影响。每处理培养30个愈伤，3次重复。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的条件下培养40 d后，观察并统计不定芽诱导情况。

1.3 数据处理与分析

试验调查统计愈伤组织诱导率、愈伤组织干鲜重、不定芽诱导率及芽长等。

愈伤组织诱导率(%)=(形成的愈伤组织数/接种的外植体数)×100%。

不定芽诱导率(%)=(诱导出的不定芽数/接种的愈伤组织数)×100%。

采用DPS(7.05)软件对数据进行处理分析，LSD方法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

2.1.1草石蚕茎段愈伤组织的诱导

当6-BA、NAA、GA3均为0时，未诱导出愈伤组织(表1)。当6-BA浓度为0时，各处理的相关指标与其他处理(6-BA浓度为2、4、6 mg·L-1)相比差别最大，说明6-BA对愈伤组织诱导的影响较大。处理16诱导的愈伤组织诱导率最大，为96.25%，处理11、14、15、10和处理12的愈伤组织诱导率分别为91.25%、88.75%、88.75%、83.75%和77.50%，处理16的愈伤组织诱导率与处理12达极显著差异水平。由以上可知，处理16的茎段愈伤组织诱导效果最好；处理12的愈伤组织鲜重最大，为0.159 g；处理16次之，为0.153 g，但两者之间未达到显著性差异水平；处理15和处理11的愈伤组织鲜重分别为0.147 g和0.139 g，并与处理12之间达到显著性差异水平。处理16的愈伤组织干重最大，为0.027 0 g；处理15、12和处理11的愈伤组织干重分别为0.026 7 g、0.025 2 g和0.020 8 g，它们与处理16之间均未达到显著性差异。处理12的愈伤组织为褐色颗粒，而处理16的愈伤组织为浅绿色颗粒，并且处理16的愈伤组织长势最好。综合考虑，处理16(MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6.0 mg·L-1)为茎段愈伤组织诱导的最佳培养基。

表2 植物生长调节剂对叶片愈伤组织诱导的影响

序号NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈伤诱导率/%鲜重/g 干重/g 愈伤颜色、质地长势10.000.00.00Fk0.000Ff0.000Fg无无20.020.575.00ABCabcd0.124DEde 0.025DEef浅绿色颗粒+++30.041.555.00BCDcdef0.173DEde0.037DEdef浅绿色颗粒++40.062.543.75CDEef0.077Ede 0.015DEef浅绿色颗粒++50.200.531.25DEfg0.044Ee0.012Eef 浅绿色颗粒++60.220.092.50Aab0.508ABab0.058CDEde褐色颗粒++70.242.551.25BCDdef0.145DEde0.025DEef 浅绿色颗粒+80.261.576.25ABab0.354BCDbc0.069BCDcd褐色颗粒+90.401.513.75Eg0.094DEde 0.003Ef 浅绿色颗粒+100.422.555.00BCDcdef0.246CDEcd0.052CDEde浅绿色颗粒++110.440.068.75ABCbcd0.523ABab0.109ABab褐色质密+120.460.590.00Aab0.440ABCb0.093ABCcd浅绿色颗粒++130.602.513.75Eg0.021Ee0.004Ef 浅黄色颗粒+140.621.566.25ABCbcd0.210DEde0.068BCDcd黑色颗粒+150.640.591.25Aab0.498ABab0.109ABab浅绿色质密+++160.660.097.50Aa0.647Aa0.132Aa浅绿色颗粒+++

2.1.2草石蚕叶片愈伤组织的诱导

由表2可知，以叶片为外植体，当6-BA、NAA、GA3均为0时，无愈伤组织被诱导出。当6-BA浓度为0时，各处理的相关指标与其他处理(6-BA浓度为2、4、6 mg·L-1)相比差别最大，说明6-BA对愈伤组织诱导的影响较大。处理16的愈伤组织诱导率最高，达97.50%，除处理15、6、12、8和处理2外，与其它处理之间均达到了显著性差异水平。处理16的鲜重和干重均最大，分别为0.647 g和0.132 g，处理11的鲜重和干重次之，处理16与处理11之间的鲜、干重差异不显著。愈伤组织颜色、质地较好的分别为处理2、3、4、5、7、9、10、12、16。愈伤组织长势良好的是处理2、15、16。综上所述，处理16为叶片愈伤组织诱导的最佳植物生长调节剂配比组合。

2.2 植物生长调节剂对不定芽分化的影响

不定芽分化是组织培养的关键步骤之一。当6-BA浓度为0时，愈伤组织不能被诱导出芽，说明6-BA在不定芽诱导中起着决定性作用(表3)；随着6-BA浓度的增高，不定芽诱导率升高。本试验不定芽诱导率最高的为处理4，诱导率达76.67%；其次为处理3，诱导率为53.33%，并与处理4之间达到极显著差异水平。在一定浓度范围内，随着NAA浓度的增加，不定芽的诱导率呈降低趋势；说明高浓度的6-BA和低浓度的NAA培养基配方有利于草石蚕不定芽的诱导，以处理4为最佳。

由表3可知，处理3分化不定芽数最多，为13.25个，其次为处理4，为11.91个，两处理间未达到显著性差异水平。不定芽长势最好的是处理2和处理4，其次是处理3。处理11的株高最大，为4.00 cm，但长势较弱，处理4的株高虽然不高，但长势最好，明显优于处理11。综合考虑，处理4(MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1)为草石蚕不定芽诱导的最佳培养基。

3 讨 论

3.1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响

草石蚕愈伤组织的高效诱导是草石蚕组织培养过程中的一个重要环节，为基因工程等研究提供技术支撑，同时，也为提取、分离其中保健及药理有效成分提供了材料。王莉以美国“草原”薄荷为材料，研究其愈伤组织中挥发油成份，认为外源类激素物质是愈伤组织诱导的重要因素[13]。张春梅等对银斑百里香研究得出，MS + NAA 0.15 mg·L-1+ 6-BA 0.6 mg·L-1是最佳的愈伤诱导培养基[14]。蔡汉权研究认为，罗勒的最佳愈伤诱导培养基是MS + NAA 0.1 mg·L-1+ 6-BA 4.0 mg·L-1[15]。张东向等研究发现，黄芩的最佳愈伤组织诱导培养基为MS + NAA0.2 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1[16]。本试验研究结果显示，草石蚕茎段和叶片愈伤组织诱导的最佳培养基为MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6 mg·L-1。王贻莲等研究得出，NAA是影响薄荷诱导愈伤的重要因素，在浓度为0.2 mg·L-1时，愈伤诱导率达92%以上[17]。许真研究认为，BA 对藠头愈伤组织的形成具有促进作用，浓度越高形成愈伤组织越多[18]。随着6-BA浓度的增加，枸杞花药愈伤组织诱导率越高，以MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1最佳[19]。本试验研究发现，6-BA对草石蚕愈伤组织诱导的影响最大，当浓度为0时，愈伤组织诱导较低，并且长势不好；当6-BA浓度为6 mg·L-1时，其愈伤组织诱导率最高，长势也最佳。这与许真[18]和段丽君[19]的研究结果一致，但与王贻莲等[17]的研究结果不同，这可能与试验材料不同有关。

表3 植物生长调节剂对不定芽诱导的影响

处理NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)接种数/个诱导数/个诱导率/%芽数/个株高/cm长势10.1003000.00Ee0.00Bd0.00Dd无 20.12130930.00Cc6.56Abc1.44BCb+++30.142301653.33Bb13.25Aa1.51Bb++40.163302376.67Aa11.91Aab0.60Cc+++50.3013000.00Ee0.00Bd0.00Dd无 60.32030413.33CDcd8.75Aabc1.03BCb+70.34330826.67CDcd3.75Ac1.73Bb+80.362301240.00Cc4.50Ac1.48Bb+90.5023000.00Ee0.00Bd0.00Dd无 100.52330516.67CDcd6.00Abc2.30Bb+110.5403013.33Dd3.00Ac4.00Aa+120.56130310.00CDcd7.00Abc2.10Bb+130.7033000.00Ee0.00Bd0.00Dd无 140.7223026.67Dd5.50Ac1.50Bb+150.74130310.00CDcd4.50Ac0.95BCb+160.7603013.33Dd4.50Ac1.85Bb+

3.2 植物生长调剂对不定芽的诱导的影响

愈伤组织诱导不定芽是脱分化细胞进行再分化的过程，其成功的关键因素是生长素和细胞分裂素的浓度配比。不同激素种类在不同植物上使用时存在很大差异[20-22]。一般情况下，诱导不定芽时，细胞分裂素要比生长素浓度高。中等浓度(1.0～2.0 mg·L-1)的细胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)与低浓度(0.1～1.0 mg·L-1)的NAA配合均能促使魔芋Ⅲ型(浅红或绿色，呈瘤状或球状，结构致密)愈伤组织再生植株[23]。陈丹萍等[12]以草石蚕茎尖、茎段组织为外植体直接诱导不定芽，得出MS+6-BA 7.0 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1为最佳培养基，茎尖和茎段的不定芽诱导率分别达39.2%和33.3%。本试验经愈伤组织间接再生途径诱导不定芽时，得出MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1培养基的效果最佳，不定芽诱导率为76.67%，大大提高了不定芽诱导率。

在辣椒材料上，诱导不定芽的6-BA最佳浓度为 5 mg·L-1，浓度太低，不定芽诱导率不高，而浓度大于 6 mg·L-1时，虽然不定芽能被大量诱导，但质量差，大部分为畸形，继续培养芽难以伸长[24-26]。张炜坤等研究认为，随6-BA浓度升高(1～3 mg·L-1)，北苍术不定芽诱导率呈先升高后降低的趋势，但6-BA浓度不能过高，当达到3 mg·L-1时，不定芽的叶片卷曲，幼苗出现玻璃化和畸形现象[27]。本研究得出，草石蚕不定芽诱导的最佳培养基为MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1，不定芽诱导率为76.67%，并且芽长势最好，这与前人研究的结果不一致，这主要是因为不同试验材料对6-BA的忍耐程度有关。林碧英等对生姜的研究表明，在NAA浓度不变的情况下，随着6-BA浓度的增加，生姜生长点成芽率下降[28]。但本研究认为，NAA浓度低时(0.1 mg·L-1和0.3 mg·L-1)，随着6-BA浓度的增加，草石蚕不定芽诱导率逐渐增加，这与林碧英等研究的结果相反，这主要是与试验材料和生长调节剂浓度不同有关。